前言
基因组学揭示了细胞的潜能，转录组学提供了细胞的蓝图。然而，要弄清楚一个细胞到底在做什么，就需要蛋白质组学和代谢组学。正如来自欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory, EMBL）的计算生物学家Alexandrov所说：“代谢组学非常重要，它是多组学中最‘年轻’的一个，但它提供了最接近表型的图景！”
通过单细胞代谢，我们可以最大程度上了解在给定细胞中正在发生的化学过程。即使是两个基因序列相同的细胞，它们的代谢组也可以有很大不同。细胞和细胞外环境通过多种分子，包括代谢物等进行动态地相互作用。例如癌细胞的肿瘤微环境中充满化学物质，阻碍免疫系统，刺激新血管的生长并引发转移。“单细胞代谢组学非常有帮助，”在约翰霍普金斯大学（Johns Hopkins University）研究癌症代谢的Anne Le说，“在单个患者的肿瘤中，你可以看到亚群以及确定哪些细胞正在做什么。”
动态性和复杂性
相比于基因组和转录组，代谢组更具有“动态性”，何为“动态性”呢？假设你对某人进行基因测序，你会发现这个人是“四分之一的法国人”，“四分之三的越南人”，你取样本的方式不会改变这个结果。如果你把样本放在室温下，然后在五天内再回来，这个样本的基因组信息仍然是一样的，但该样本的代谢组信息可能发生改变，代谢组不会只是坐在那里等着你。样品制备是准确获得样品代谢组信息的关键，液氮快速冷冻是一种常见的方法。使用有机溶剂也有助于提取代谢物，例如乙腈用于基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)。宾夕法尼亚州立大学（Pennsylvania State University）的 Hua Tian课题组开发了一种叫做气体团簇离子-次级离子质谱技术(GCIB-SIMS)的方法，用冷冻水合法储备样品，该方法在空间和时间上“冻结”了生物系统，并提供了生物系统的最接近自然状态的“快照”，而冷冻干燥或其他化学固定物与之相比则更容易损耗样品的代谢信息。
除了动态性，代谢组信息还具有复杂性，代谢物有各种不同的形状和大小，它们有数百万种，其中仅约有5%可以从质谱数据中确定地识别出来。代谢物识别是代谢组学的基本问题之一。为了帮助从光谱结果里混乱的峰谱中梳理出具体的信息，Alexandrov的团队创建了METASPACE（https://metaspace2020.eu/），一个基于代谢物识别算法的开放平台知识库，供人们共享他们的成像质谱数据。该平台目前在全世界范围内，约有100个实验室在使用，其更好地帮助生物学家们理解他们手上代谢组信息的分子内容，而不需要手动浏览与未知分子对应的无数个光谱峰。
此外，单细胞代谢组学面临着细胞基质的数量和细胞产物的数量缺乏线性关系的难题。转录组学和蛋白质组学方法可能揭示了一个细胞产生一种特定的酶，并产生了一个合理的期望——即细胞也包含由该酶作用的分子。但这些分子可能会形成中间产物或被卷入副反应，产生不可预测的新产物，还有极少数非酶催化反应，即自发反应，这些反应很难被预测。虽然代谢组学可能无法测量细胞完整的化学物含量，但提高测序通量和灵敏度的新技术正在产生大量新的生物信息。
揭秘分化
脊椎动物生命的伟大奇迹呈现在单个细胞，即受精卵，如何包含了产生数十种不同的特殊细胞类型所需的所有信息。虽然基因组通常被认为是“生命的说明书”，但受精卵的DNA不会在繁殖和分化时发生改变。在整个发育阶段，基因组基本保持不变，而这些变化是由代谢组驱动的。
马里兰大学帕克分校（University of Maryland, College Park）的 Peter Nemes和他的团队研发出了一种分析青蛙胚胎单个细胞代谢物的方法。在胚胎发育过程中，细胞分裂迅速，从一个较大的细胞分裂成两个较小的细胞，大约每25小时，细胞数量翻一番，大小减半。Nemes说：“在这样的空间和时间不断发展的样本中研究单细胞代谢组学是一个真正的挑战。”首先，当胚胎处于四细胞阶段时，Nemes和他的团队使用光学显微镜来识别左背细胞和左腹细胞，并使用精密微毛细管，抽吸出单个细胞内容物的样本。毛细管电泳分离代谢物，然后进行电喷雾电离和高分辨率质谱分析来识别和量化分子。而这个取样的过程，并不会损害胚胎发育成正常蝌蚪的能力。“由于毛细管提取比传统的解剖方法造成的损伤更小，细胞的压力更小。”Nemes解释道，“这使得我们可以重复取样，而这更接近于测量细胞的真实代谢组信息，而不是经历过氧化应激的细胞。”对同一细胞反复取样的能力也使研究人员能够在活的发育胚胎中，将代谢组学和蛋白质组学结合起来研究，蝌蚪发育过程中解剖结构或行为的任何变化都可能与蛋白质组和代谢组的变化相关联。
而相比于单细胞转录组学，目前还没有一种技术可以将细胞中所有代谢物的拷贝数放大数百万倍，因此获得足够的敏感性亦是单细胞代谢组学的另一项挑战。而Nemes团队的方法在多个方面提高了检测的灵敏度，首先毛细管电泳有效地分离样品中的分子，产生清晰的峰。接着，他们基于人工神经网络研发了一个名为 Trace的分析软件来定位代谢物的离子信号，该软件相比于其他分析软件大大减少了假阳性结果带来的噪音干扰。基于此方法，Nemes团队记录了八细胞青蛙胚胎中细胞之间代谢物组成的差异。他们已经证明，代谢物驱动干细胞分化为器官特异性细胞，而改变细胞中的代谢物可以改变该细胞的命运，通过单细胞代谢组学研究，可以将一个将分化为表皮细胞的细胞重新“编程”成神经组织细胞，反之亦然。
图1. 微毛细管从八细胞非洲爪蟾胚胎抽吸出单个细胞内容物的样本（源自Nemes团队）
空间关系
检测单个细胞的代谢组信息并保持细胞间的空间关系，将带来更多的生物信息。一个细胞的生长微环境将影响其代谢，因此研究员们正在研发比较一群同源细胞之间的单细胞代谢组学数据的方法。
MALDI质谱分子成像技术是目前最常用的单细胞代谢分析技术之一。对于MALDI，要分析的样品与基质混合，然后用紫外激光束照射。光束将分析物解离，将它们送入质谱仪。MALDI-MS具有小样品制备和高通量的特点，并已成功用于揭示单细胞生物克隆群体之间的异质性，并用于发现组织样本中罕见的细胞亚型。MALDI质谱分子成像技术可测量组织切片或含有电镀细胞的载玻片上不同点的质谱，使研究人员能够创建代谢物的空间地图，然而，将代谢物丰度测出并精准对应上来源的单细胞对研究人员来说是一个挑战。
为了解决MALDI成像的空间分辨率不够高的问题，Alexandrov团队开发了SpaceM，它将MALDI成像与光学显微镜和数字图像处理相结合，以精确地将质谱数据与其对应的来源细胞相匹配。MALDI激光在基质中产生可见的灼烧痕迹作为标记，在进行MALDI成像之前，研究人员使用显微镜来捕获细胞的相对位置、它们的荧光表型和任何其他相关信息。在使用MALDI成像收集代谢物数据后，再拍摄第二张显微镜图像，显示标记的位置，通过这些标记确定代谢物数据是从哪个细胞中收集的。而以亚细胞精度把前后图像线性对应上是一个关键步骤，Alexandrov团队在载玻片或者切片边缘创建了一个基准，基于上千个基准的自动识别，可实现亚细胞精度的图像对应。同时SpaceM还具有高通量检测的特点，在单个载玻片中可以成像数千个细胞。
Alexandrov团队与德国癌症研究中心的 Mathias Heikenwälder团队的炎症专家合作，使用SpaceM分析人类非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)这两种脂质代谢紊乱的体外模型的肝细胞脂质组成，SpaceM显示，大量的NAFLD细胞亚群（约四分之一）显示出脂滴和中性脂质的积累，被确认为是与疾病相关的代谢状态，在他们用炎症细胞因子诱导NASH后，约93%的细胞呈现了此代谢状态。
图2. 单细胞水平非酒精性脂肪肝相关的脂肪酸代谢的变化（源自Alexandrov团队）
Alexandrov指出：“这种检测群体中单个细胞代谢异质性的能力也可能应用于癌症和免疫代谢，如果我们知道癌细胞如何适应它们的新陈代谢，那么我们就可以帮助免疫细胞适应新陈代谢，在肿瘤微环境中发挥功能。”在不分离组织内容的情况下，了解其中不同细胞的代谢状态至关重要，这是生物分析的新前沿领域，这将有助于我们理解为什么一些免疫细胞可以穿透肿瘤微环境，而有些则不能。
宾夕法尼亚州立大学的 Hua Tian团队使用的GCIB-SIMS是一种不需要特殊制备并保持细胞间空间关系的方法。GCIB-SIMS用一束高能离子束轰击细胞，驱逐飞走的离子，并收集到质谱仪中。该技术结合了质谱的化学特异性,并拥有接近1 um的成像分辨率，小到足以成像单个细胞。与使用单原子离子束相比，使用气体团簇离子束对生物标本造成的损害更小，可以用于检测大质量的生物分子。Hua Tian团队近来开发了一种基于水簇离子束和碳簇离子束相结合的次级离子质谱分析法，水簇光束在不破坏样品的情况下检测代谢产物，细胞用镧系标记的抗体标记细胞类型，这些抗体使用碳簇束检测。通过该方法，Hua Tian团队在单个细胞水平整合了脂质信息，代谢信息和蛋白质信息，发现了新的肿瘤微环境信息，例如，肿瘤上皮细胞具有增强的抗氧化途径，而快速分裂的细胞具有高水平的神经节苷脂。这种多组学的方法为研究癌细胞和免疫细胞之间的相互作用以及其他系统中的细胞之间的相互作用打开了大门。
图3. 乳腺癌肿瘤微环境中不同的细胞类型及其代谢组信息（源自Hua Tian团队）
囊泡
“你如何识别一个细胞的细胞类型是什么？”在美国伊利诺伊大学（University of Illinois）研究分析性神经化学的Jonathan Sweedler问道。早期的医生根据不同脑细胞的形状或在显微镜下的样子给它们命名，星形胶质细胞、锥体细胞、枝状吊灯细胞等，但这种命名方法并不能揭示细胞的功能。随着神经科学家开发出测量大脑中生物化学物质的方法，细胞被它们释放的化学物质所定义：细胞可以是多巴胺能类型、羟色胺能类型、氨基丁酸能类型等，但这些名称与形态学类别并不完全重叠。
相同的星形胶质细胞面对不同的神经元细胞，例如分泌谷氨酸和氨基丁酸作为神经递质的神经元细胞或者分泌多巴胺和血清素作为神经递质的神经元细胞，它们会有不同的转运体和酶来处理这些信号，这些差异是否意味着它们是一种不同的细胞类型？同一个细胞在不同环境中，具有不同的代谢组信息。因此Sweedler教授更关注于细胞的本身状态而非细胞的类型。神经元细胞将化学信号，如激素和神经递质，包裹成脂质囊，称为囊泡。囊泡是比细胞更小的单位，一个细胞包含大量的囊泡，而Sweedler团队采用MALDI-MS来分析这些单独的囊泡，并探究其异质性。
Sweedler团队的研究人员将数千个细胞器分散在一个显微镜载玻片上，它们之间有足够的空间，从而激光一次只能击中一个物体。接下来，他们用显微镜对载玻片及其物体进行成像。然后，一个机器学习系统对图像进行分类，识别出最有可能是囊泡物体的坐标，这些坐标被用来引导质谱仪激光器进行瞄准，这一自动化的过程能够在一张载玻片中捕获数千个光谱。Sweedler团队使用海蛞蝓的细胞作为研究对象，因为它们的细胞器相当大，直径约为0.5-2微米。他们确定了三个不同的密集核心囊泡群体，它们包含不同的，但重叠的肽激素的分布。
对单细胞水平上囊泡的研究有助于提高我们对涉及细胞间信号传导的疾病的理解，以及激素和神经递质在各种生理功能中发挥作用，如昼夜节律、维持水-钠平衡调节等功能。
溶酶体
囊泡使细胞之间的交流成为可能，而溶酶体可能是保持我们身体年轻的原因。大多数真核细胞含有溶酶体，即充满消化酶的膜结合细胞器，可以分解细胞蛋白质或摧毁细菌和病毒，它们的新陈代谢也非常活跃。中国科学技术大学的熊伟教授解释道：“溶酶体对于维持能量和代谢稳态、信号转导、受损蛋白质和细胞器的恢复至关重要。”
溶酶体在细胞衰老和癌症中都发挥着作用，了解细胞内部发生的代谢过程可以有助于得到关于如何减缓衰老或肿瘤的新药物靶点的信息。但是溶酶体是高度异质性的：一个单个细胞可能包含数百个，它们的大小、密度和酶的组成都不同。“虽然研究人员已经确定了几种不同类型的溶酶体，但到目前为止，还没有令人满意的溶酶体分类方法，”熊伟教授说，“考虑到它们在生理和病理过程中发挥功能的巨大异质性，单溶酶体技术的发展是充分了解不同类型溶酶体特征的先决条件。”
熊伟教授团队已经创建了一个单溶酶体质谱(SLMS)平台，该平台结合了溶酶体膜片钳记录技术与基于纳米材料的电喷雾电离质谱技术，同时检测溶酶体的电生理特性及其代谢组信息。熊伟教授团队根据溶酶体代谢组信息，将溶酶体分为五种亚型。其中两种亚型对应于先前假设的溶酶体类型，即自噬溶酶体和内溶酶体，而另外其他三种亚型都是新发现，而来自完全不同细胞类型的五个溶酶体亚群之间存在着惊人的一致性。SLMS方法还成功地检测到氨基酸、糖类及其衍生物的信息，熊伟教授团队研究表明随着细胞年龄的增长，溶酶体在分解大型生物分子方面的效率降低了。同样，研究人员发现，不同类型癌细胞中的溶酶体中的代谢组信息存在差异。
正如熊伟教授所说：“越来越多的证据表明，衰老和癌症与溶酶体及其内部代谢过程密切相关，通过研究不同类型的溶酶体在衰老或癌症过程中的代谢功能变化，就有可能开发出新的抗衰老或抗癌药物。”
嘌呤小体
空间解析单细胞水平的代谢组还可以为细胞如何进行其化学反应提供证据，如生物合成。当细胞分裂时，它们需要一种自己制造“建筑材料”的方法——从头嘌呤合成是细胞从头开始产生更多嘌呤核苷酸的过程，这种方法受到癌细胞和其他快速增殖细胞的青睐，而正常细胞则倾向于通过补救合成途径回收嘌呤。
Hua Tian团队与在宾夕法尼亚州立大学研究酶复合物组装和动力学的Stephen Benkovic合作，使用GCIB-SIMS寻找“嘌呤小体”，这是细胞中生物合成研究的热点，可以证明酶簇的假说。嘌呤的生物合成利用了来自线粒体的代谢物，研究人员假设，从头嘌呤生物合成的中间产物和最终产物将定位于线粒体附近，而不是扩散到整个细胞中。事实上，这就是他们的发现。Hua Tian团队使用GCIB-SIMS来定位中间产物，GCIB-SIMS提供了一个1微米乘1微米像素的细胞图，该高分辨率小到足以捕获嘌呤小体。他们发现了嘌呤合成酶复合物中的代谢通道和与线粒体关联的直接证据，同时他们发现了一些离散的高浓度的中间代谢物AICAR，以及嘌呤生物合成过程中的其他明显的中间产物。“这真的为单细胞代谢组学提供了一个新的机会，”Hua Tian说，“它可以帮助发现癌症治疗中重要的代谢弱点”
小结
单细胞代谢组学比基因组学或转录组学提出了更多的前沿挑战，推进单细胞代谢组学，研究人员将解决几个关键点：
1、代谢组变化迅速，这意味着在收集一个样本进行分析的过程中，该样本的代谢组可能发生改变。
2、代谢物在单个细胞中的表达丰度可能差异很大，微少的代谢物含量需要高灵敏度方法来检测。
3、与基因组和转录组只有几个不同的核苷酸碱基不同，代谢物有各种形状和大小，需要开发有效的软件方法来区分异构体。
4、为了了解异质细胞群是如何相互作用的，分析细胞的原生环境，将代谢组数据与细胞的物理特征和细胞微环境准确匹配变得至关重要。
随着研究人员开始克服这些挑战，其给精准医疗的发展带来的获益变得更加突出。例如，利用代谢组学来研究从患者的肿瘤样本中培养的类器官。多种药物可以同时在类器官上进行测试，而不是用药物治疗癌症患者并等待观察是否有响应。单细胞代谢组学可以揭示肿瘤细胞对每种药物的应答，而这种应答是细胞在自然状态下最真实的反应，这就是单细胞代谢组学的魅力！
随着单细胞代谢组学技术的不断发展，一场代谢组学革命正从早期组学中接过接力棒，向我们走来！
参考文献：
Single-cell metabolomics hits its stride
Published online: 3 December 2021 https://doi.org/10.1038/s41592-021-01333-x
文章解读尽在 生信人公众号
网友评论