本期将以阿斯利康公司发表的文献为基础，为大家介绍肿瘤用药「Tagrisso」在开发过程中对部分伴随诊断方法的研究结果。
「目 录」
-
泰瑞沙
耐药突变
泰瑞沙的特性 -
伴随诊断
罗氏 cobas 系统上的 qPCR 方法
Qiagen 公司的 ARMS PCR 方法
Bio-Rad 公司的 ddPCR
Sysmex 公司的 BEAMing dPCR -
实验结果
TEST 1
TEST 2
TEST 4 -
尾巴
泰瑞沙
Tagrisso，中文音译泰瑞沙，是由阿斯利康公司发开的一种针对 EGFR 基因有耐药基因突变的晚期 NSCLC 患者的第三代肺癌靶向药。其通用名是「osimertinib(奥希替尼)」，内部编号AZD9291，是一个酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine-kinaseinhibitor, TKI)类的靶向抗癌药物。其最大的特点是对 EGFR 已经产生耐药突变的肿瘤仍有较好的治疗效果，同时副作用较小。
该药物于 2015 年末经 FDA 批准上市，并于 2017 年获得 CFDA 许可在中国大陆上市，批准的适应症是患有 EGFR T790M 突变的 NSCLC。
耐药突变
以易瑞沙为例，这是早期的第一代靶向药，但是在用药 10-14 个月左右，就有可能出现耐药，其主要原因就是 EGFR 基因发生耐药突变：
T790M 突变
EGFR 的第 790 个氨基酸残基从苏氨酸变成了甲硫氨酸。在所有的发生易瑞沙耐药的肺癌当中，60%是有 T790M 突变的。
L858R 突变
EGFR 的第 858 号氨基酸残基从亮氨酸变成了精氨酸，这个突变能使肿瘤对易瑞沙敏感。
19 号外显子缺失
有这种突变，也会让肿瘤细胞对易瑞沙敏感。
🔎
扩展阅读：
泰瑞沙的特性
不可逆抑制
泰瑞沙对上述三种突变均有抑制作用，而且是通过与 EGFR 蛋白分子形成共价键，达到不可逆的抑制。
选择性抑制
泰瑞沙对突变型 EGFR 的半效抑制浓度远低于对野生型 EGFR 的数据，表明其对于突变型 EGFR 有很好的选择性抑制作用，而对野生型 EGFR 的抑制作用较弱。
「正常的表皮细胞生长，需要有一定的 EGFR 活性。」
以往易瑞沙等酪氨酸激酶抑制剂类的抗癌药物，常有明显的副作用——皮肤瘙痒和腹泻。
我们已经学过，EGFR 全称「促表皮生长因子受体」，顾名思义，其酪氨酸激酶的酶活性能促进表皮生长。
而皮肤，是长在身体外面的表皮；肠道，是长在身体里面的表皮，是面对食物和糞便的表皮。
如果表皮的生长受到抑制，表皮中的细胞就得不到应有的更新。这时身体外面的皮肤就会发生皮疹、和瘙痒；身体里面的肠道表皮，就会发生溃疡、引发腹泻。
由于泰瑞沙可以选择性抑制突变型的 EGFR，也就是对发生耐药的肿瘤有强抑制作用，而对野生型的 EGFR 的抑制作用较弱。也就是说，其对机体正常表皮细胞的生长抑制作用较弱，这也正好是治疗 EGFR 突变型耐药的肿瘤最需要的药物特性。
伴随诊断
同样，也正是因为泰瑞沙的选择性抑制，所以医生在用药前必须做伴随诊断。
接下来，开始介绍阿斯利康对泰瑞沙伴随诊断的研究结果[1]：
首先，取样方法都是液体活检，检测样本均来自患者 ctDNA。
🔎
有关 ctDNA 更多内容可参阅：
罗氏 cobas 系统上的 qPCR 方法
具体是运动 Taqman 探针法的荧光实时定量 PCR，相信大家都在本科分子生物学课程中有所学习，此处不再赘述。
Qiagen 公司的 ARMS PCR 方法
ARMS PCR 指「Amplification Refractory Mutationsystem PCR」。
其原理是把要检测的突变位点，放在一个 PCR 扩增引物的 3'位最末一个碱基。
如果 DNA 模板上有突变，这个模板就会和 PCR 引物互补，聚合反应就会发生。最后就会扩增出 DNA 片段，就会有荧光信号。
反之，PCR 引物的 3'端与模板不匹配，聚合反应就不容易发生，也就没有荧光信号。
Bio-Rad 公司的 ddPCR
本方案在 《陈巍学基因》笔记(17)微滴数字PCR 和 《陈巍学基因》笔记(18)抽血测EGFR突变 有详细介绍，此处亦不再赘述。
Sysmex 公司的 BEAMing dPCR
BEAMing 指 Beads, Emulsions, Amplification, and Magnetics + 数字化 PCR。
其原理也是基于油包水 PCR：
-
首先，准备好带有针对目标基因片段引物的磁珠，抽提好 cfDNA。
-
抽提好的 cfDNA，与磁珠、配对 PCR 引物、聚合酶、PCR 底物、扩增缓冲液等做成一个 PCR 混合溶液。其中 cfDNA 模板和磁珠是限量因子，其它的都是过量的。
-
把这个混合液和矿物油进行混合。通过振荡，制备成油包水的乳浊液，油相就把水相分隔成许多个小液滴。每一个小液滴就成为一个小的独立 PCR 反应体系。
-
这个乳浊液放到 PCR 热循环仪中进行扩增反应。如果一个小液滴当中，凑齐了：磁珠、一个目标 DNA 片段，再加上有过量的配对 PCR 引物、聚合酶、PCR 底物，PCR 反应就会发生。磁珠上就会长出许多个源自同一个模板的 DNA 链来。
-
PCR 反应结束之后，打破小液滴，回收磁珠。
-
用两种带荧光的探针对磁珠进行杂交。这两种探针，一种是带红荧光，序列是针对突变 DNA 序列的；另一种带有绿荧光，其序列是针对野生 DNA 序列的。
-
杂交之后，用流式细胞仪对磁珠上的荧光探针颜色进行判读。根据是否有红色荧光磁珠，以及红色荧光磁珠的数量，与绿色荧光磁珠的数量比例，就可以知道：是否有突变的目标基因，以及突变的目标基因占总体目标基因的比例。
-
因为最后的读到的数据，是一个一个的磁珠上的荧光信号，所以，它的数据应当是数字化的，而不是模拟量的。
-
同时，它一次反应，可以读到上千万个磁珠，数据采样量极大。
实验结果
TEST 1
论文中第一阶段用 38 例样本，用上述的 4 种平台进行检测。同时用组织中抽到的 DNA 的检测结果，作为标准对照。
可以看出，
- 第一列的 cobas 方法和第四列 BEAMing 方法均有较好的灵敏度和特异性。
- ARMS 方法，在对 T790M 的检测中，灵敏度较低(仅 29%)。
- ddPCR 方法，对于 T790M 和 L858R 都有很好的灵敏度和特异性，但是，ddPCR 方法不能做第 19 号外显子的缺失突变。
最后 cobas 和 BEAMing 方法进入第二阶段测试。
TEST 2
在第二阶段，阿斯利康做了 72 例样本的检测同样，以组织样本的 T790M 突变检测结果作为参考标准，来进行比照。
-
BEAMing 方法的灵敏度达到 81%，而 cobas 的灵敏度只有 73%。也就是说，BEAMing 方法的灵敏度比 cobas 方法的灵敏度更高。
-
BEAMing 方法的特异性是 58%，而 cobas 方法的特异性是 67%。也就是说，以组织样本的检测结果为准，BEAMing 方法的特异性低于 cobas 方法。
TEST 4
上述两种方法又进行第四项测试。
在 cobas 和 BEAMing 这两种方法的检测结果之间，有较好的结果一致性。虽然有 6 个样本，cobas 测出来是阴性，而 BEAMing 测出来是阳性，但这 6 个样本 BEAMing 测出来的数值接近 BEAMing 检测的下限，在 0.02%到 0.2%之间。
也就是说，两个平台之间的差别，更多的是 2 个平台的检测灵敏度下限之间的差别，而不是检测准确性的差别。
同时，两种 cfDNA 的方法与组织样本检测方法的结果的差异，可能是因为肿瘤组织的异质性所导致的。因为取肿瘤组织的时候，会有一定的代表性的问题，而 cfDNA 来自全身，所以几乎没有异质性的问题。
另外，文章特别指出：用 cfDNA 方法测出来的，有 T790M 突变的病例，对泰瑞沙治疗有响应的比例是 59%；而用组织检测，测出有 T790M 突变的病例，对泰瑞沙治疗，有响应的比例，是 61%，两者在误差范围内保持一致。
最后，cobas 方法被 FDA 选为标准的泰瑞沙伴随诊断的方法。
尾巴
-
qPCR 仪是医院检验科很普及的诊断仪器，所以 FDA 把伴随诊断的许可证发放给了罗氏的 cobas qPCR 方法，可能是考虑了诊断方法在医院中的实际可操作性。
-
BEAMing 方法，目前还属于「Laboratory Developed Test」，也就是一个较新的方法，还不是一个完全成熟的商业化方法。这可能是 FDA 没有批准 BEAMing 方法的原因。
- 但是，因为 BEAMing 方法比 cobas 方法有更好的灵敏度，所以，目前阿斯利康公司正在努力推进 BEAMing 方法，希望它成为美国市场外标准的泰瑞沙伴随诊断方法。此举可能让医生开出更多使用泰瑞沙进行治疗的处方。
- 2019 年，中国国家药品监督管理局(NMPA)正式批准泰瑞沙用于 19 号外显子缺失突变和 L858R 突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者的一线治疗。
References
[1]Thress, K. S., Brant, R., Carr, T. H., Dearden, S., Jenkins, S., Brown, H., … Barrett, J. C. (2015). EGFR mutation detection in ctDNA from NSCLC patient plasma: A cross-platform comparison of leading technologies to support the clinical development of AZD9291. Lung Cancer, 90(3), 509–515. :doi:10.1016/j.lungcan.2015.10.004
网友评论