作者：oct
审稿：童蒙
编辑：angelica
外显子组（Exome）是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，是遗传物质中编码蛋白质的DNA序列，占整个基因组的1%-2%。外显子组分析有助检测出和疾病相关的编码区突变，从而研究DNA变异对正常生物学机制与疾病发病机制的影响。
外显子测序已经在多种单基因遗传病研究、多基因遗传病研究、肿瘤研究及产前诊断中得到了应用。实验方面作为其中重要的一个环节，对数据以及后续的分析有着极为关键的影响，对此我们特邀实验专家给大家讲讲那些实验上的事儿~
捕获特异性偏低的原因有哪些？
外显子测序目前常用的平台之一为Agilent SureSelect Human All Exon V6捕获平台，该平台捕获率高，基本可达到70%以上。如果出现捕获特异性低于70%，从实验环节考虑，有可能是以下几个方面导致：
（1）插入片段偏大，文库之间部分杂交，导致含有部分非目的片段的序列被捕获。外显子平均长度160bp，文库最好在200-500bp，使得目标外显子序列覆盖范围大，邻近内含子区域测序最少。
（2）杂交投入量过高，影响捕获的最佳动力学状态，同时也会影响封闭的效率。
（3）杂交和洗杂交的操作严谨性，合适的盐浓度和漂洗温度可保证获得稳定的捕获效率。
dup率偏高的原因有哪些？
1. 样本来源：血液样本与ffpe样本完整度不同，ffpe样本中存在交联、脱氨基以及物理损伤，所以ffpe样本的dup率会高于正常血液样本。
2. 样本片段化：不同的片段化方法也有不同的偏好，应尽量选择随机片段化的方法。片段越小，PCR bias越多，会导致dup率偏高。
3. 文库构建：应尽量提高文库转化率，减少低频目标片段丢失。接头后纯化尽量减少接头的残留，避免影响PCR效率。尽量提高单个文库的杂交投入量。保证杂交过程操作的严谨性。良好的实验习惯，比如取100ng DNA，5ul和1ul分子多样性不同，且取样前注意混匀。
4. PCR循环数：捕获前和捕获后的PCR循环数越低越好，但要保证与背景分离。
5. 测序环节：测序错误、测序过程的光学分辨率、cluster的生成、测序试剂质量都会影响dup率的产生。
影响覆盖均一度的因素有哪些？
目前评价覆盖均一度的指标主要有Fold80，或不同深度下的覆盖率。影响覆盖均一度的因素主要有以下几点：
1. 芯片设计
不同厂家的芯片设计原理不同，芯片设计的均一性直接影响目标区域的覆盖均一度指标。可通过标准品测试不同厂家芯片的覆盖度均一性。
2. 样本质量
a.样本完整度，ffpe样本大多存在降解，血液和新鲜组织样本完整度会较高。b.样本纯度，主要看是否有RNA、蛋白质、糖分的污染。c.样本总量，我们对于建库的DNA起始投入量是有要求的，一般200ng。血液和新鲜组织提取出的DNA量通常情况下都足够。
3. PCR效率
PCR效率可能会改变不同区域文库的比例，但是通常这部分影响不大，只有当文库发生极为显著的不均一扩增时，才会影响覆盖度和均一性。
近期我们会不定期推出各类产品常见问题，希望能帮助大家解决各种疑难杂症，请大家拭目以待！
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