OcBSA 适用与F1分离群体的BSA算法

马铃薯、苹果、梨，桃子、茶树等等许多植物具有异花授粉的特性，并且相关性状在F1单株中发生分离。异交植物自交不亲和，或者繁殖周期长，难以培育成自交系用于遗传育种研究，严重阻碍了重要性状的遗传解析。所以构建F1分离群体进行QTL定位成为较为常见的方法。

OcBSA算法完全建立在F1分离群体的遗传特征上。如下图所示，F1子代的马铃薯颜色完全由P1的两个单体型控制，得到h1的就是紫色，得到h2的就是黄色，跟亲本2的两个单体型完全没有关系。所以OcBSA核心就是剔除后代混池数据中来自P2的单体型。该算法已经在马铃薯，苹果，葡萄，茶树，桃子，等物种上验证过，得到非常准确的结果。

image.png

OcBSA提供了非常简单易用的工具，供用户定位，画图，批量设计分子标记引物。值得注意的是F1子代的分子标记的开发也和其他类型的群体不一样，也要符合其遗传规律才可以，所以OcBSA提供了批量设计引物的功能。

OcBSA的安装使用

## 下载安装
git clone https://gitee.com/Bioinformaticslab/OcBSA.git
##运行-p1就是提供显性亲本在VCF的列数，可以从第一列开始数（从0开始），也可以从倒数最后一列开始数（从-1开始）;
##-p2就是不提供显性性状的亲本;-b1 和p1性状一样的混池；## -vcf就是最最原始的vcf，不要进行任何过滤！！！；-w 窗口大小
python OC_BSA.py -vcf ./potato_example.vcf -p1 10 -p2 9 -b1 11 -b2 12 -w 200000 -o ./potato_example.vcf_200k_OCBSA.txt

##已经运行完上面的步骤，假如觉得窗口大小不合适，可以使用之前产生的*.OcValue文件快速改变窗口。
python OC_BSA.py  -OcValue potato_example.vcf_200k_OCBSA.txt.OcValue -w 100000 -o ./potato_example.vcf_100k_OCBSA.txt

其他参数

-p1 PARENT1 (Column number of dominant parent in the VCF (Counting from 0); 显性亲本在vcf中的列数 (从0开始数))
-p2 PARENT2 (Column number of another parent in the VCF(Counting from 0); 隐性亲本在vcf中的列数 (从0开始数))
-b1 POOL1 (Column number of pool with dominant trait in the VCF (Counting from 0); 具有显性表型的混池在vcf中的列数 (从0开始数))
-b2 POOL2 (Column number of pool with Recessive trait in the VCF (Counting from 0); 具有隐性表型的混池在vcf中的列数 (从0开始数))
-d1 PARENTDEP1 (Minimum coverage of the parents; 亲本的最低覆盖度, 用来过滤位点，低于这个阈值的位点都舍弃)
-d2 POOLDEP1 (Minimum coverage of the pools; 混池的最低覆盖度, 用来过滤位点，低于这个阈值的位点都舍弃)
-d3 PARENTDEP2 (Maximum coverage of the parents; 亲本的最高覆盖度, 用来过滤位点，高于这个阈值的位点都舍弃)
-d4 POOLDEP2 (Maximum coverage of the pools; 混池的最高覆盖度, 用来过滤位点，高于这个阈值的位点都舍弃)
-w WIN (Size of sliding windows; 滑窗的大小)
-vcf INPUT_VCF (Path of VCF file; vcf文件 )
-table INPUT_FORMAT (Path of simple VCF file; 本程序简易的VCF文件格式,替换VCF文件的输入 
-OcValue INPUT_OcValue (如果只是调整窗口大小, 可以使用之前生成的中间文件(.OcValue))
-o OUT (Name of output file; 输出文件名)

输出结果介绍

.##potato_example.vcf_200k_OCBSA.txt.OcValue

这个文件包含了每个位点的OcValue值，包含了位点的坐标，亲本子代的基因型信息，以及每个位点的阈值，倒数第二列是Ocvalue，最后一列标注了这个位点的类型，SNP，或者InDel。PAV的意思是其中一个亲本丢掉了这个位点，可能是存在缺失变异，导致这个片段丢了。

image.png

.##potato_example.vcf_1M_OCBSA.txt

每一行是一个滑窗的结果，步长是窗口的十分之一。第二列是每个窗口的中点，假如你的窗口是1 Mb, 那这行就代表，这个中点前面500 kb 和后面500 kb。然后是滑窗的阈值和OcValue，最后一列代表这个窗口内的标记数量（SNP+InDel+PAV）

image.png

.##potato_example.vcf.table

简易的基因型文件，分别是染色体，坐标，参考基因型，突变基因型，P1的两个基因型的覆盖度，P2、混池1，混池2。OcBSA运行时也可以使用这种文件来替换VCF文件，使用-table参数。

image.png

画图

##支持输出png和PDF
python bsa_fig.py -f potato_example.vcf_200k_OCBSA.txt -OcValue -o test.png
##假如只想看某一段区间的结果，可以使用这个参数-p， -c 可以调整颜色，可以在这个网站选择想用的颜色https://matplotlib.org/stable/gallery/color/colormap_reference.html
python bsa_fig.py -f potato_example.vcf_200k_OCBSA.txt -p chr10,50000000,60000000 -OcValue -o test.png

每个点代表一个窗口，颜色就代表这个窗口内的变异位点的数量，变异位点越多，就代表这个OcValue更可靠。右边的图，是指定某个区间绘制出来的图。

image.png

引物设计

##使用批量引物设计前需要安转一个模块
##为了可以得到特异的引物，会将得到的引物比对回基因组所以还需要用户安装blast软件。
conda install primer3-py
## -g,call 变异使用的参考基因组。-OcValue 就是OcBSA产生的中间文件，包含每个位点的OcValue结果的文件。
## -i 想要设计引物的区间，-f输出的文件夹
python primer_design.py -g ./rerence_genome.fa -OcValue ./output.vcf.OcValue -i chr10,56000000,57000000 -f ./primer/

output.primer.extracted 是结果文件，包含了所有可用标记的引物，每个标记有十对引物。

F2/RILS分离群体

OcBSA还提供了snpindex算法和ED算法供用户使用

snpindex

#Run with vcf
python F2_BSA.py -snpindex -p1 -4 -p2 -3 -b1 -2 -b2 -1 -vcf test.vcf.vcf.table -o test.vcf_1M_snpindex.txt

#Run with table
python F2_BSA.py -snpindex -table example_file/F2_test.table -o test.table_1M_snpindex.txt

#plot 
python bsa_fig.py -f test.table_1M_snpindex.txt -snpindex -o test.png
python bsa_fig.py -f test.table_1M_snpindex.txt -snpindex -o test.png -p Chr01,1000000,16000000

ED

#Run with vcf
python F2_BSA.py -ED -p1 -4 -p2 -3 -b1 -2 -b2 -1 -vcf test.vcf -o test.vcf_1M_ED.txt

#Run with table
python F2_BSA.py -ED -table example_file/F2_test.table  -o test.table_1M_ED.txt 

#plot 
python bsa_fig.py -f test.vcf_1M_ED.txt -snpindex -o test.png
python bsa_fig.py -f test.vcf_1M_ED.txt -snpindex -o test.png -p Chr01,1000000,16000000

单株测序的样本合并为混池

假如是单株测序的样本，再得到VCF后，可以提供两个混池的样本，根据VCF中的各个样本的基因型混成两个混池

python cluster_vcf.py -c individual_sequencing.vcf -f pool_config.txt -o out_table.txt 

-c就是包含所有单株和亲本的VCF文件

-o 得到简易的基因型文件，可以使用-table参数提供给OcBSA使用。

-f 文件中指定亲本和混池的样本名，如下：

B1：混池1，B2：混池2，P1：亲本1，P2：亲本2

B1:sampleID1,sampleID2,sampleID3,sampleID4,sampleID5,sampleID6,sampleID7,sampleID8,sampleID9,sampleID10,
B2:sampleID11,sampleID12,sampleID13,sampleID14,sampleID15,sampleID16,sampleID17,sampleID18,sampleID19,sampleID20,
P1:sampleID_P1
P2:sampleID_P2