严重急性呼吸系统综合症冠状病毒-2 (SARS-CoV-2) 感染是 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 的起源，炎症反应加剧、持续的病毒载量和抗病毒防御途径缺陷等疾病恶化因素可能导致急性呼吸衰竭、败血症和死亡。因此，确定潜在的细胞和分子机制对于了解 COVID-19 病理生理学和指导适当疗法的开发至关重要。本研究收集了 15 名中度或重度 COVID-19 肺炎患者在入住重症监护病房后的第 1 天和第 4 天的血液，利用单细胞测序技术生成了一个抗原呈递细胞（APCs） 的独特数据集，发现了重症患者特定 APCs 抗病毒免疫防御的多过程缺陷, 并提出恢复有缺陷的免疫防御的策略。本研究题目为Single-cell RNA sequencing of blood antigen-presenting cells in severe COVID-19 reveals multi-process defects in antiviral immunity，2021年5月份发表在Nature Cell Biology（IF=28.820）。
1.COVID-19患者APCs亚群分布
为了刻画循环血中的抗原呈递细胞分子谱，作者从5个中度新冠患者、10个重度新冠患者中，分别在患者入院第一天和第四天取外周血，同和健康对照样本单细胞分选后进行10X单细胞测序。对细胞cluster进行经典marker的手工注释，UMAP分析展示了42784个抗原呈递细胞的分群信息，总共分为六个亚群，并且这种分群独立于新冠疾病进程的严重程度。至此，作者构建了新冠患者APCs的全面图谱。
图1COVID-19循环APC子集多样性
2.炎性相关的通路是COVID-19抗原呈递细胞的hallmark
接下来作者在不同新冠严重程度的APCs中进行差异表达分析，利用差异表达基因进行功能富集分析，试图识别区分不同严重程度组和健康对照的功能通路。作者发现中度COVID-19患者的APCs中富集了IFN-γ和IFN-α应答通路，而重度COVID-19患者的APCs则富集到缺氧和TNF-α信号通路。此外，IFN-γ和IFN-α通路可以在全局水平上区分中度和重度APCs，这表明与中度APCs相比，重度APCs的抗原呈递和抗病毒活性减少。
图2 COVID-19 APCs炎症相关通路的增加
3.COVID-19 抗原呈递细胞中IFN反应缺陷
有报道称COVID-19中炎症细胞因子升高，因此作者探讨了APCs对炎症细胞因子及其受体表达的贡献。与健康人APCs相比，不同严重程度的新冠样本中IL1B、CXCL2、CXCL8和CCL3均显著升高，而IL18均降低。TGFB1和IL10RA的表达在重度新冠中降低，但在中度新冠没有降低。此外，作者发现IFNL1、IFNL1R、IFNAR1、IFNAR2、IFNA1、IFNGR1和IFNGR2的表达水平，并通过热图进一步探讨了它们在三种严重程度组中的分布，重度新冠患者的APCs表达较低水平的IFN分子，表明IFN信号通路存在潜在缺陷，IFN在严重COVID-19 APCs中的下游功能出现了全局扰动。
图3 在严重COVID-19中，与促炎细胞因子相关的下游通路的激活与IFN应答缺陷相关
4.严重COVID-19 pDCs中的多进程效应缺陷
在整体层面分析COVID-19 APCs后，作者试图解读特定APCs亚群中发生的变化。为了描述pDC亚群中发生的变化，作者分离并重新聚类了pDC，并在三个不同严重程度的分组中进行两两差异表达。重度新冠患者IFNG、IFNA以及MYC通路均比较低，并且通过多种机制实现的，说明了重度COVID-19 pDC效应通路多进程缺陷。
图4 严重COVID-19 pDC效应通路多进程缺陷
5.单核细胞亚群的协调转录适应过程
通过独立成分分析进行降维分析，并根据其疾病严重程度分组突出显示细胞。作者观察到IC1可以清晰地将中度CD14+细胞和重度CD14+单核细胞分离出来，而IC2将健康对照与COVID-19 CD14+单核细胞区分开来。此外，中度患者单核细胞亚群中抗病毒ISGs (IFITM1, IFITM3, IFI27, MZB1和IFI6)和HLA-II基因(HLA-DRB5)的表达水平均增加了，表明这是一个有效的抗病毒方案。对IC1和IC2的前50个基因的功能富集分析确定了关键途径，包括补体生成、TNF-α、KRAS、缺氧信号通路在新冠患者单核细胞中上调，而IFN-α和IFN-γ应答信号通路在重度新冠中降低。总的来说，疾病相关的分子变化在CD16+和CD14+的细胞中能被平行观察到，提示这两种细胞具有共同的适应机制。
图5 解剖所有单核细胞(CD14+和CD16+)亚群的炎症和抗病毒反应途径
6.CLEC9A+ DC和AS-DC特异性转录改变
得益于细胞分选方法，作者又详细探索了DC的两种亚型：CLEC9A+ DC 和AS-DC。差异表达分析显示，重度新冠AS-DC中显著上调SEPT7和AREG，同时显著下调HLA-DQA2基因和抗病毒IFI27。在寻找这些变化的上游调节机制时，使用Dorothea算法推断TF活性，并使用Viper推理工具进行评分。这确定了大量高度不同的TF活性分数。在中度AS-DC中，作者观察到IRF1、IRF9和STAT2的活性得分较高，据报道这些活性参与了ISG转录周期。CLEC9A+ DC亚群中的DEGs包括将中度和重度COVID-19患者与健康对照分离开的特异性转录特征，最重要的是CLEC9A+ DC在中重度患者中的分布支持前文所述的抗病毒免疫缺陷的问题。
图6 罕见的CLEC9A+和AS-DC子集中的分子和功能模块
7.CD1C+ DC中MHC-II和CIITA活性的下调
接下来作者聚焦于疾病诱导的CD1C+ DC的改变，首先探索了MHC-II相关基因的基因表达水平，注意到HLA-II基因的整体减少(主要是重症COVID-19患者的HLA-DQA2和HLA-DRB5)。与健康对照相比，重症患者CD1C+ DC的HLA-II特征显著降低，这与重症患者中上游MHC-II调控因子(包括RFX5、RFXANK和CIITA)表达降低有关。此外，激活RELA(NFKB超家族)和AP-1的TF活性较高，包括FOSL1、FOSL2和JUN，它们调控大量细胞过程，包括细胞存活、死亡和增殖。此外，作者还发现重症COVID-19患者DC-T细胞通信的受到的干扰。
图7 发现的重症COVID-19 CD1C+ DC中MHC-II下调和上游转录调控因子
图8 发现重症COVID-19患者DC-T细胞通信的干扰
本文小结：
在本文中，我们对来自 COVID-19 患者的新鲜外周血的所有 APC 子集进行了高分辨率单细胞 RNA 测序 分析，对以前外周血单核细胞 (PBMC) scRNAseq 研究中未捕获的罕见 DC 子集进行刻画，揭示了重度 COVID-19患者以前未被发现的免疫多进程缺陷。
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