- 蛋白样品制备
- 蛋白定量
- 蛋白电泳
- 洗板
- 插板,灌Dd水:10min看漏不漏
（电泳液：没过底端，没过短板，不到长板） - 配分离胶，两板是14.
总14： 水，arc，分，APS,. TEMED （前三个可以先配，最后两个会凝，先加tem再加aps会立即凝）
洗梳子
加APS,. TEMED，混匀
在板里加胶，在一个点加，加到线上1cm，最后灌水，灌满 - 配浓缩胶。 配5%
倒水，灌浓缩胶
插梳子 等30min - 煮样 2min
- 装入盒。 拿出 Marker
先灌电泳液，后拔梳子 - 上样。 每个道上7ul（variable）
Marker上两边 3.5ul -
插电极(带箭头的是正极)。 浓缩胶80v. 1h? 50min
中间要赶气泡 电泳液易跑没，中间要加。样品跑成一条线（浓缩胶与分离胶的交界）的时候调电压
image.png
分离胶120v
- 三明治。 一层海绵垫，4滤纸。
记住正面！！贴着胶的是正面
放在转膜液里， 赶气泡
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切膜（长8.5cm,宽0.8 cm），标记都是哪些蛋白，甲醇激活膜，膜的右上角作记号知道是正面！
image.png
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切胶。 切一整块。 赶气泡
放膜。 放在 目标蛋白➕内参的分子量处.
转膜。 放到架子里。周围要有冰.胶在负极，膜在正极,黑胶白膜
恒压。 100v,90min。 转膜时间大于分子量.(如果分子量差的很大，把膜切开，用两个盒子转) -
取膜，封闭。 放入BSA(放磷酸化的蛋白)（TBST稀释，5%）或脱脂牛奶，摇1h
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膜在tbst中洗。 5min*3
手套封膜，机器压膜温度调4，压紧，两边封两道，放入膜，装一抗，赶气泡
稀释一抗，TBST稀释，比例
稀释二抗，TBST稀释，比例 鼠1：5000 -
孵育一抗，放冰盒里 摇16h
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回收一抗。 Tbst洗三次，一次10min
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孵育二抗，孵2h（或1h，太久背景明显）室温，回收的抗体if时间久，可孵育时间长点。 二抗都是一样的么？鼠，兔的！
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回收二抗。 取膜放入TBST中洗，洗三遍，每次10分钟，摇。
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配发光液. 1:1。immobilon
机器提前打开，喷水，放手套，
膜正面朝上。 与胶接触的是正面
凝胶成像。Chemical hi res
内参显像，一般为10s
放置凝胶
开始运行
考走图像
倒预装的running
加RBS(封死不跑),marker,各种蛋白
接上电泳 80 后120
切胶 切需要的蛋白。根据分子量
在transfer里泡 把膜也泡 摇床泡半个小时。 先把蓝色的膜在甲醛里泡 然后再转到胶里。
放在板子里～两张白的一个在甲醛里泡过的膜然后放胶 插上电极版一个小时
取膜。取下来放在奶粉里泡一小时
裁膜 放到一抗里 1%BSA和抗体配制
二抗 带标签HRP。可以加发光液然后发光
封膜，
分离胶要灌高点If分子量大
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