嵌合抗原受体（CAR）疗法在B细胞和浆细胞肿瘤中表现出显著的临床活性，验证了该疗法类别在液态癌症中的使用，然而，耐药性和应用范围的限制仍是广泛应用的难题。这篇综述回顾了当前CAR的免疫生物学和设计原则，并介绍了预计将推动未来临床进展的新兴平台。该领域正在快速扩展下一代CAR免疫细胞技术，这些技术旨在提升疗效、增强安全性和可接入性。在提升免疫细胞适应性、激活内源性免疫、武装细胞以抵抗肿瘤微环境的抑制，以及调节抗原密度阈值的方法上已取得了实质性的进展。越来越复杂的多特异性、逻辑门控和可调节CAR显示出克服耐药性和提高安全性的潜力。隐蔽式、无病毒和体内基因传递技术的初步发展为降低细胞疗法的成本和提高其广泛应用提供了可能性。CAR T细胞在液态癌症中持续的临床成功正在推动越来越复杂的免疫细胞疗法的发展，这些疗法预计在未来几年内将转化为用于治疗实体瘤和非恶性疾病的治疗方法。
引言
嵌合抗原受体（CAR）是合成模块化蛋白，可重定向免疫细胞以应对在恶性肿瘤细胞上表达的目标抗原。这种灵活的平台在治疗B细胞和浆细胞恶性肿瘤方面已经显示出了显著的临床效果，因此，这种疗法的应用潜力正推动着科技的快速发展以及来自学术界和生物制药行业的大规模投资。美国食品和药物管理局（FDA）已经批准了六种CAR T细胞产品，包括用于大B细胞淋巴瘤（LBCL）、B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、滤泡状淋巴瘤和其他12种病症的治疗。在关键的临床试验中，CD19-CAR疗法在LBCL的二线治疗中表现优于标准护理疗法（SOC），并且作为一线治疗非常有效，为其在早期疾病阶段的应用铺平了道路。现在，针对CD19的CAR疗法已经不再是唯一选择。有两种针对BCMA（又名TNF受体超家族成员17）的CAR T细胞疗法已经获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，用于治疗多发性骨髓瘤。此外，还有针对其他目标的CAR疗法在治疗其他类型的白血病和淋巴瘤中也展示了很高的效果，包括CD22、CD30、CD7、CD20和GPRC5D。为了降低CAR T细胞治疗的风险，现在已经有标准的毒性评估和管理流程，使得与CAR T细胞治疗相关的死亡率得以降低
虽然我们在CAR-T细胞疗法上取得了一些进展，但仍有很多问题需要解决。对于接受商业化CAR-T细胞治疗的B细胞癌症患者来说，只有不到一半的人能得到持久的疾病控制。在实体肿瘤的治疗上，CAR-T细胞疗法虽然显示出一些有效性，但是持久并且一致的高效反应的证据仍未明确。此外，从患者体内提取细胞制备CAR-T细胞的过程既耗费时间又需要大量资金，而现在的商业化生产能力还无法满足所有的临床需求。该综述阐述了对CAR-T细胞免疫生物学的当前理解，强调了癌症中的耐药机制、设计原则，以及增强疗效的新兴方法。我们主要关注开发用于癌症治疗的CAR T细胞，但许多原则与其他用于癌症的免疫细胞疗法和开发用于非恶性疾病的细胞疗法的新兴尝试有关。
CAR-T免疫生物学及其耐药机制
许多团体长期广泛地致力于为癌症开发免疫细胞疗法，这些努力对于CAR-T疗法的成功至关重要（图1）。CAR是由Eshhar和他的同事们发明的，目标是利用自然T细胞的扩张、杀伤和持久性，同时克服T细胞受体（TCR）的主要组织相容性复合体（MHC）限制，以实现更广泛的治疗适用性。经过许多集团的反复优化，一个融合了scFv作为抗原结合域、铰链/跨膜域、TCRζ和CD28或4-1BB共刺激末端结构域的受体，最终成为了CAR的原型（图2）。这种结构被FDA批准的六种药物中的五种采用，而第六种药物则在保持同样的结构的基础上，使用两个纳米抗体重链（Vhh）作为抗原结合区。1.5-2.2千基对（kb）的受体的抗原结合过程在很大程度上复制了自然T细胞中由TCR-CD3复合体介导的抗原特异性激活和杀伤，然而，CAR T细胞和自然T细胞的生物学之间存在显著差异，这为这些治疗剂的应用提供了机遇和挑战。
由于抗原调节产生的耐药
CAR和TCR信号传导之间的一个主要区别是，CAR需要更高的抗原密度才能完全激活T细胞。尽管单链变量片段（scFvs）与TCRs相比具有更高的亲和力，并且CAR的表达密度通常比TCR-CD3复合体高，但TCRs对每个抗原呈现细胞中不到100个肽就可以完全引发激活，而CAR则需要每个目标细胞上有超过1000个目标分子。这种差异的原因包括CAR对近端激酶招募的减少，免疫突触的发展程度较低，共受体的参与程度减少，以及对下游负调节因子的更大诱导，其中部分与强直信号有关，其中CAR的聚集，通常由scFv驱动，诱导抗原无关的激活。CAR原型设计的修改在一定程度上可以调整抗原密度阈值，其中调节信号强度、scFv亲和力、CAR表达密度、铰链/跨膜结构和突触间距的特征都会产生重要影响（图2）。由于更大的信号强度降低了抗原密度阈值，因此增强T细胞适应性的特征，无论CAR设计如何，也会降低CAR抗原密度阈值。这些见解对于开发安全有效的CAR T细胞疗法至关重要，因为毒性和有效性与靶向抗原的表达特性密切相关。靶向那些对生命至关重要的组织中不存在的分子的CAR，例如B细胞系列抗原，应被设计为在低抗原密度下激活，以降低低抗原复发的风险，而靶向那些在癌症中高度表达但在重要的组织中表达低的分子的CAR，应被设计为具有更高的抗原密度阈值，以利用基于差异抗原密度的治疗窗口。
抗原调节是B细胞恶性肿瘤中CAR T细胞失去作用的主要原因，而在实体瘤中，大部分可靶向的抗原都表现出显著的异质性，这可能会带来更大的挑战。在儿童和青少年的B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中，约50%的复发与CD19丧失有关，而在大B细胞淋巴瘤(LBCL)中，约30%的复发为CD19阴性，另有30%的复发在商业化CAR的抗原密度阈值以下表达CD19。多发性骨髓瘤中BCMA-CAR T疗法对抗原变化的抵抗作用定义不明确。基础的BCMA表达水平在患者中异质性大，且与临床反应无关。BCMA丧失 — 与基因突变和缺失相关 — 是抵抗的罕见原因（不到5%的病例），然而，在BCMA-CAR治疗后可观察到抗原调节。抗原密度可以通过各种机制进行调节，包括基因突变、RNA选择性剪接、细胞谱系转换、表观遗传、转录后机制、胞啃作用、超糖基化以及抗原脱落。一些目标的下调可以通过小分子药物进行治疗干预，如用bryostatin来上调CD22，用 azacitidine来上调CD70，以及用γ-分泌酶抑制剂来上调BCMA，这些药物能抑制抗原脱落。
T细胞功能低下导致耐药
CAR T细胞抵抗的第二个主要原因与T细胞的效能、持续性、功能持久性和/或功能障碍不足有关，这通常与在没有抗原调节的情况下疾病复发有关。功能障碍通常是由T细胞耗竭引起的，这是通过全局转录和表观遗传重编程引导的终末分化的结果。在T细胞收集、制造的CAR T细胞产品中，有时可以观察到T细胞耗竭，而经过高肿瘤负荷后也会诱导耗竭。CAR结构中的内部因素也会导致耗竭，其中共刺激领域起主要作用。与4-1BB和第一代CARs相比，CD28协同刺激的CARs表现出更快更大的扩增，分泌更多的炎性细胞因子，而且由于T细胞耗竭，其存在的时间相对较短。在某些情况下，4-1BB和第一代CARs可能可以持续存在数年。在存在强直信号（tonic signalling）的CARs中，CD28协同刺激结构域对于加速T细胞耗竭的影响尤为显著。强直信号的影响取决于信号的强度，并且与环境有关，一些CARs在存在强直信号的情况下可以表现出更好的功能和持久性。通过在CD3ζ或CD28结构域中进行突变，降低基于CD28的CARs的信号强度，可以减轻其对T细胞耗竭的倾向，从而提高其持久性。值得注意的是，最近一项长期跟踪研究表明，长寿的CARs都是CD4阳性的，这引发了一个设想：这一亚群可能更不容易耗竭，从而展示出更高的持久性。
CD28与4-1BB协同刺激的CARs存在时间较短的临床效应因疾病而异。在大B细胞淋巴瘤（LBCL）中，肿瘤的消除发生得非常快，CD28和4-1BB协同刺激的CAR T细胞表现出类似的疗效。然而，在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中，CAR T细胞的存在时间超过6个月与复发率增加有关——因此，除非患者在CAR治疗后接受骨髓移植以巩固缓解状况，否则CD28协同刺激的CAR T细胞的效果较差。在多发性骨髓瘤中，抗BCMA-CAR T细胞的功能持久性与响应时间的延长相关。目前还不清楚对于实体瘤来说，是更偏好CD28还是4-1BB的协同刺激，因为强烈的信号强度和持久性都是desirable。同时包含CD28和4-1BB协同刺激结构域的CARs并未表现出优势，这使得研究人员开始尝试整合新的或者合成的协同刺激结构域，目标是赋予最大的信号强度和持久性。通过CAR的合并筛选，已经用来识别最佳的CAR信号结构域和设计，并阐明CAR设计原则。全基因组CRISPR筛选已经确定CD2-CD58轴作为T细胞效能的介导者，并已证明IFNγR信号传导在实体瘤中（而非液态瘤）对于CAR T细胞的粘附和细胞毒性是必需的。CAR T细胞的效能也受到肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制分子（TGFβ、IL-10、IL-6和检查点分子）的限制，目前正在进行的工作包括将CAR T细胞疗法与免疫调节剂结合，旨在激活TME内的免疫应答，并赋予免疫细胞抵抗特定的免疫抑制介质的能力（见box1）。
转运受损与局部给药
另外，受损的到达肿瘤部位的运输可能也会限制CAR T细胞的效果，特别是在实体瘤中。在中枢神经系统肿瘤的预临床模型中，肿瘤内或脑室内（ICV）给药已经显示出改善疗效，局部剂量大约降低十倍就能达到与静脉给药相同的效果。几项临床试验已经证明了将CAR T细胞局部区域性地输入到中枢神经系统的安全性，对于一位多形性胶质瘤患者，ICV输送的IL-13Rα2 CAR T细胞诱发了完全反应，而肿瘤内给药则未见有效。在一项对弥漫性中线胶质瘤患者的研究中，ICV输送的GD2-CAR T细胞诱发了抗肿瘤效果和临床反应，并且重复给药与持续的益处相关，这提出了一个可能性，即向中枢神经系统的输送可能消除免疫敏化，这可能限制了多剂量静脉CAR T细胞方案的有效性（ In a study of patients with diffuse midline gliomas, ICV delivery of GD2-CAR T cells induced antitumour effects and clinical responses, and repeated dosing was associated with sustained benefit, raising the prospect that delivery to the central nervous system may abrogate immune sensitization, which has probably limited the effectiveness of multidose intravenous CAR T cell regimens.）。在涉及胸膜的肺癌患者中，间皮素-CAR T细胞的区域递送与PD-1阻断相结合，介导稳定的疾病和代谢反应。另外，正在研究的策略是让T细胞自身产生IL-7和CCL19，以改善它们对肿瘤微环境的定位和在其中的持久性。
下一代CAR-T细胞
本节将讨论用于克服肿瘤抗性机制、增强免疫细胞活力、提高特异性、调整CAR信号、提高安全性和增加抗原敏感性的各种下一代平台。
减少抗原逃逸
双特异性CAR靶向可通过施用混合细胞产品、两个受体的双区表达、两个scFvs并入一个受体或多个CAR的共同转导来实现，每种方法都带来了机遇和挑战。共同输注（co-infusion）在经济、人力和细胞资源上都需要大量投入，而共同转导（co-transduction）会生成多样性的产物，这种情况下可能会出现某一亚群体在输注后主导整个细胞群体，从而产生风险。双区表达可能会导致蛋白表达降低，在一项临床试验中，双区表达的CAR-T显示出有限的持久性。已经报告了几项针对CD19加CD20或CD22的双特异性受体的试验，在其中一项中，该受体对CD22的效力降低，而且肿瘤细胞变种显示出CD19的表面表达量低或无表达。FDA近期批准的BCMA-CAR（双特异性骆驼抗体胞外域结合部位抗原受体）cilta-cel，包含在一个受体中的两个串联Vhh结合物，它们可以结合到BCMA上的两个不同的表位。cilta-cel的临床结果显示，83%的患者达到了严格完全缓解（sCR），并且在27个月的无进展生存率（PFS）为55%，这是到目前为止使用CARs治疗多发性骨髓瘤报告的最高值（表1）。总的来说，多特异性CARs的临床数据还处于初期阶段，但已经展示出安全性和通过减少抗原逃逸来提高效果的潜力。
为降低抗原密度阈值而设计的新型受体也在开发中。Katsarou和他的同事已经表达了一种嵌合的共刺激受体(CCR)，它缺乏cd3ζ结构域，并报告说，CCR的参与在非常低的抗原密度下激活了CAR-T细胞，防止了临床前模型中的抗原低逃逸。对非CAR T细胞抗原产生抗肿瘤反应--如在一位患有横纹肌肉瘤的患者接受CAR T细胞治疗后所报道的--可能会减少由抗原调节引起的抗性。有几种方法正在开发中，以增强先天和适应性免疫（box1），包括CAR介导的免疫刺激RNA RN7SL1的传递，共同表达配体或重塑TME的细胞因子，如IL-12、IL-18、CD40L或Flt3L、 设计CAR T细胞以分泌双特异性T细胞诱导剂（BiTEs），利用CAR T细胞在肿瘤部位的积累，避免BiTE的全身毒性，或使用可能介导更有力的内源性抗肿瘤活性的非传统免疫细胞。
增强T细胞功能
大量增强免疫细胞的适应性的研究正在进行中（见图3和box1）。大部分的工作集中在表观遗传调控上，部分原因是在一项针对慢性淋巴细胞白血病的CD19-CAR临床试验中，有一位异常反应良好的患者，慢病毒整合破坏了TET2基因，这是DNA甲基化的介导者，导致了大量的克隆性T细胞增殖和持续的抗肿瘤反应。同样地，DNMT3A基因的敲除在预临床模型中增强了CAR T细胞的抗肿瘤活性。通过过表达转录因子来防止耗竭也显示出了潜力，包括过表达AP-1因子JUN，这增强了T细胞的扩增和持续性，减少了末端分化，降低了抗原密度阈值，这可能是由于信号强度的增加。类似地，BATF转录因子的过度表达已经被报道可以增强T细胞的效力。正在开发制造策略，以优化CAR T细胞的表型，朝向干细胞样和中心记忆亚群，包括缩短培养时间，抑制PI3K–mTOR–AKT，BTK或酪氨酸激酶信号，以及在促进记忆的细胞因子中培养。
CRISPR介导的基因编辑首次在采用的T细胞疗法中临床应用，在这种疗法中，PD-1被从工程化的细胞中删除，这些细胞被设计来表达NY-ESO-1，一种癌症特异性的TCR转基因。这些工程化的细胞并没有显示出增强的持久性或效力，但该研究证明了该方法的可行性和安全性，并加速了应用基因编辑技术以增强免疫细胞疗法的努力。已经有一些基因被确定为候选基因，以增强T细胞的适应性（box1），并且CRISPR介导的T细胞标志物如CD7和CD5的破坏使CAR T细胞疗法能够用于T细胞恶性病，同时避免了CAR T细胞的溶解（被称为‘同类杀伐’）。我们预计将有越来越多的临床试验活动，将基因编辑的免疫细胞整合到采用的免疫细胞疗法平台中，以增强其效力，扩大可靶向抗原的范围，并避免免疫敏感化。
为了增强持久性，一些研究人员已经试图将细胞因子信号整合到CAR受体中，或者转基因表达细胞因子，包括一个临床试验，其中表达CAR的自然杀伤细胞转基因表达IL-15显示出持久的存在。免疫排斥也可能限制CAR T细胞的持久性，因为可以在许多病人体内测量到针对小鼠、人源化或全人scFvs的抗CAR免疫反应。同样的，临床经验显示，第二次和随后的静脉内CAR T细胞的效用有限，可以通过使用淋巴清除方案来改善。这些发现提出了这样的前景，即正在开发的stealth平台，能够通过增强持久性或启用多次CAR T剂量方案来增强CAR T细胞的效能，从而使现成的异体产品成为可能。
当前正在进行多种努力以解决抑制性的肿瘤微环境（TME）（见Box1），包括基因消融或表达占优势的TBGβ、PD-1或Fas受体，以及工程化CAR T细胞分泌检查点阻断scFvs。一些研究者已经设计出切换受体，这是一种融合蛋白，能够将TME中的抑制信号转换为CAR T细胞中的激活信号。然而，由这种受体引发的持续激活信号是否会导致长期的CAR T细胞增强或使它们倾向于耗竭和终末分化，这仍有待确定。此外，也正在探索基于生物材料的方法来增强细胞的扩增和持久性。
CAR调控与可调节平台
大量的研究工作正在进行，旨在通过调节或抑制CAR信号传导来提高安全性和效力，以降低毒性和耗竭。这个概念最初是由Eyquem等人提出的，他们使用CRISPR技术将CAR受体敲入TRAC位点，并观察到由于内源性TRAC调控元件介导的抗原诱导的CAR下调，CAR-T细胞的效力和耗竭有所改善。韦伯和他的同事们利用合成生物学或小分子技术暂时停止CAR信号，当在制造过程中使用时，这种方法能提高CAR-T细胞的效力，在移植后体内应用时，能提高抗肿瘤效果。
如iCasp9、HSV酪氨酸激酶（HSV-tk）和表位标签等"杀手开关"能够在出现严重毒性的情况下清除工程化的细胞，而且，我们已经开发出一种使T细胞对尿苷有需求的无转基因的安全开关。调节性平台不仅可以作为可逆的安全开关，还可以调整CAR的信号，从而提供防止T细胞耗竭的休息期，提高T细胞的效力。我们已经开发出众多的可调节平台，这些平台采用了药物敏感的启动子、诱导二聚化、分裂式CAR、药物依赖的激活剂、蛋白质降解的嵌合物（PROTACs）、化学依赖性降解领域和药物调控的CAR蛋白质降解等技术。这些系统代表了合成生物学的重大进展，但仍然面临着关闭状态下有毒性风险的泄漏活动、开启状态下CAR表达或活性减弱以及使用免疫抑制药物作为调节器的挑战。
Labanieh等人最近开发了一种蛋白酶调控的Grazoprer诱导的 "药物ON "平台，即 signal neutralization by an inhibitable protease (SNIP)，它显示出无泄漏的活性和完整的功能能力（图3）。最近，Labanieh等研究者开发了一种新型的受蛋白酶调控的药物激活平台，称为“SNIP”。该平台在未被激活的状态下没有残留活性，并且在被药物（如Grazoprer）激活后能全面发挥作用（如图3所示）。和synNotch系统类似，SNIP能够降低CAR T细胞的耗竭程度，从而提高其抗肿瘤效果。在一个特定的实验模型中，通过降低Grazoprer的剂量，研究者能够调节SNIP-CAR的活性，这样就能找到一个治疗的窗口，在该窗口中，健康的正常细胞可以存活，而表达ROR1的肿瘤细胞则会被消灭。同样地，Hernandez-Lopez等人改进了synNotch平台，使其能够在避免攻击正常细胞的同时，有效地对付高度表达肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞。因此，这种可调节的CAR技术显示出了在提高疗效和减少毒性方面的潜力。
通过布尔逻辑增强特异性
B细胞和浆细胞恶性肿瘤特别适合接受CAR-T细胞治疗，因为这些细胞高度、均匀地表达的抗原主要在B细胞和浆细胞上共表达，而这些细胞的消耗是可以容忍的。然而，最近的一篇病例报告显示，一名患者在接受BCMA-CAR T细胞治疗后出现了帕金森病症状，尸检分析显示在患者的基底节神经元和星形胶质细胞子集中表达有BCMA。在另一项研究中，单细胞RNA测序分析显示脑壁细胞上表达有CD19，这提出了一个可能性，即CD19-CAR T细胞治疗后的神经毒性可能是由于准确打击目标细胞所致。这些结果突显了确定不在重要组织上表达的靶标的挑战。
到目前为止，由于实体瘤表面缺乏特异性肿瘤标志物，CAR T细胞疗法的应用在实体瘤中仍受限，针对CAIX和CEACAM5的CARs在临床试验中观察到了不可接受的靶向肿瘤外毒性。然而，针对实体瘤的CAR T细胞和其他强效的抗体导向疗法的几项临床试验已展现出良好的安全性档案（表1）。CAR抗原密度高的阈值可能解释了为何能安全靶向某些已知在重要组织上有表达的抗原，如在神经组织上低表达的GD2。最近一项试验显示，针对claudin-18.2的CARs展示了有希望的临床活性，并与显著但非剂量限制性的毒性相关，这可能是由于抗原表达局限于胃粘膜中深层的分化上皮细胞，这些细胞对CAR T细胞可能较难接触。寻找具有足够差异性表达的可安全靶向的分子，如癌胚表面靶标（oncofetal cell-surface targets），对于将CAR T细胞疗法扩展到B细胞和浆细胞恶性瘤以外是至关重要的。然而，随着实施增强效能和持久性的策略，将需要持续重新评估特定靶标的安全性，如在最近的一项研究中，一个整合了有着优势负性TGFβ受体的针对PSMA的CAR与致命毒性相关。
包含逻辑门的下一代受体可以通过组合抗原感应更好地区分肿瘤和健康组织，并扩大潜在抗原的范围（图3）。Roybal等人开发了synNotch，这是一个IF-THEN电路，包含了一个针对抗原A的受体，一旦接触，就会触发针对抗原B的传统CAR的转录。synNotch系统还没有经过临床测试，但在临床前模型中，当肿瘤和易感的重要组织不在一起时，它可以防止目标上、非肿瘤的毒性。Tousley等人开发了一个名为LINK的AND门平台，它利用了近端TCR信号分子LAT和SLP76，每个分子都融合了一个膜结合的scFv，对一个独特的抗原进行特异性处理。在一个针对ROR1的模型中，该模型的目标是对肿瘤进行精确定位，但可能对非肿瘤组织产生毒性。在这个模型中，LINK CAR T细胞能够消除表达两种抗原的肿瘤，而不会引起与ROR1相关的毒性。然而，接受synNotch T细胞治疗的小鼠却无法承受这种毒性。目前正在开发的其他用于组合抗原定位的方法包括SUPRA和co-LOCKR，它们通过蛋白质开关机制来改变CAR T细胞的靶向性。尽管通过组合抗原识别可能会扩大可供靶向的肿瘤抗原的范围，但肿瘤因丢失其中任何一种抗原而逃脱的风险可能会增加。另一种提高特异性的方法是使用“与非”逻辑门，该方法包括将激活性CAR与一种抑制性CAR（iCAR）同时表达，其中iCAR靶向在健康组织上但非肿瘤组织上表达的抗原。目前，“与非”逻辑门的应用尚处于初步阶段，且还未在临床上进行测试。
TCR样的CAR
以靶向低水平表达的抗原为目标，通过对内源性TRAC基因座进行基因编辑，将内源性TCR的可变区改变为单链抗体的不依赖于人类白细胞抗原的TCRs(HIT)。当CD80和4-1BBL以反式形式提供时，靶向CD19的HITS显示出比原始的CD19-CARS更高的抗原敏感性(图3)。合成TCR和抗原受体（STARs）具有类似的设计，但没有敲入TRAC基因座；因此，内源性TCR的特异性得到了保留。其他重定向TCR特异性的方法包括抗体-TCR（AbTCR）平台，它用Fab片段取代TCRγδ的可变结构域，以及TCR融合构建体（TRuC），它将scFv与CD3亚单位融合。最近对TCR类嵌合受体的比较表明，STAR和HIT受体能重现TCR抗原的敏感性，而TruCs却不能。与天然T细胞相比，CAR T细胞的一个潜在缺陷是不能靶向细胞内抗原，因为大多数导致癌症的异常蛋白都是细胞内的。Yarmarkovich等人克服了这一点，开发了一种针对MHC(PMHC)呈现的多肽的CAR。他们利用了一种能特异性识别并结合在神经母细胞瘤中过度表达的PHOX2B肽-MHC复合体的scFv结合子，这使得他们能够针对多种HLA等位基因的pMHC进行靶向。这种策略可能大大扩展CAR T细胞治疗的目标范围，包括关键的癌症驱动因素。
增加可及性和效率
人们正在采用各种方式，目的是扩大细胞治疗的应用范围，降低其生产成本，研制出可以抵抗排斥的隐形免疫细胞，并充分利用其他免疫细胞的独特特性。
分布式制造和同种异体产品
随着工程技术的进步，自动化封闭系统的制造已经实现，这为现场制造打开了新的可能，从而减少了中心化制造模式（即行业标准）带来的成本、延误和物流问题。最近的一项多中心研究证实了现场制造细胞的安全性和效能。目前，确定现场制造的监管要求尤其受到关注，特别是针对罕见病，如儿童癌症的治疗。
通过利用来自健康的'超级捐赠者'制造异源性CAR T细胞，我们有可能提升治疗效力，避免已存在的T细胞功能障碍，同时降低生产成本和物流难题，从而提高治疗的普及性。然而，异源性T细胞疗法面临着要克服TCR介导的GVHD风险以及宿主免疫系统可能对移植细胞产生的排斥反应。虽然基因编辑技术可以消除内源性TCR，从而消除GVHD的风险，但要使细胞具有避开免疫排斥的隐形特性依然是一大挑战，因为CD8+细胞、CD4+细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞均有可能对异源性细胞产生排斥，每种细胞的调控机制都不同，因此需要进行多种优化措施（详见Box 1）。例如，敲除β2-微球蛋白可以消除HLA-I类的表面表达，但这反而可能增加自然杀伤细胞的排斥风险。此外，诱导异源性耐受的策略包括敲除CIITA基因消除MHC II类表达，以及通过过表达HLA-E和CD47来减少自然杀伤细胞和巨噬细胞对细胞的排斥。
大量异源性策略都采用了CRISPR-Cas9技术，而当用单一的生产过程制造成百上千的异源产品时，基于CRISPR的突变事件的风险可能会被放大。由于它们很可能因为没有双链DNA断裂而降低了风险，基因编辑和primer编辑等替代平台可能会逐渐成为以核酸酶为基础的基因编辑的更好选择。另外，以RNA为目标的CRISPR-Cas系统也可以为多重基因敲除提供机会，与RNA介导的干扰相比，其特异性和效率更高。尽管包含多重基因编辑的异源供体细胞可能具有重大优势，但这些技术仍处于初期阶段，其毒性特性尚未明确。有些研究团队尝试通过增强宿主的免疫抑制来防止免疫排斥，他们使用传统的化疗或免疫抑制抗体，而这些抗体的靶点则从CAR T细胞中被编辑掉。这种策略的初期响应率令人充满希望，但其长期安全性和有效性尚未得到证实，且对于与强烈的免疫清除方案相关的感染风险的担忧依然存在。
可替代的免疫细胞
包括自然杀伤细胞、iNKT细胞、γδ T细胞和巨噬细胞在内的多种非T免疫细胞显示出天然的抗肿瘤活性，并且不会诱导GVHD，这为他们可能提供一种减轻毒性、增强肿瘤迁移能力，或者通过天然识别肿瘤来针对抗原阴性变体的即用型细胞源提供了可能性。然而，异源性天然免疫细胞仍容易被排斥，如果这些细胞未经精心设计以降低被识别概率，这就引发了人们对其效果持久性的担忧。脐带血衍生的异体自然杀伤细胞结合异位表达的IL-15，在一期试验中显示出治疗NHL和CLL的前景。在小鼠模型中，iNKT-CAR细胞通过部分激发宿主CD8细胞对肿瘤抗原的反应表现出活性，并且其在一项针对神经母细胞瘤的初级临床试验中已经显示出安全性和可能性。此外，工程改造后能表达CD20-CAR的γδ T细胞在早期研究中也表现出了显著的活性。尽管在巨噬细胞中表达CAR需要对载体和信号域进行大量调整，但是预实验模型已经证明其具有增强吞噬、改变肿瘤微环境和吸引T细胞等抗肿瘤效果，其中，以CD3ζ为基础的CAR与以Fcγ为基础的CAR显示出相似的吞噬活性。现在，人们也在努力研发诱导多能干细胞（iPS）衍生的CAR T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞。iPS细胞向自然杀伤细胞的分化特别成功，这些即时使用的疗法的临床测试目前正在进行。而相比之下，iPS细胞分化为具有完全功能的T细胞则更为挑战性。鉴于iPS细胞衍生产品几乎拥有无尽的扩张潜力，它们可以实现大规模生产具有多种增强特性的均一细胞产品，包括赋予其隐形属性、安全开关以及有效性。因此，人们对这些新兴平台的长期安全性和有效性结果充满了期待。
下一代基因传递技术
病毒载体的基因传递一直被认为是这个领域的黄金标准，然而病毒载体的制造和鉴定过程既花费高昂又耗时。目前，正在研发无病毒的基因传递平台，虽然DNA模板对T细胞具有毒性，且这种方法的效率仍然不如病毒载体，但已经通过在人T细胞中使用基于CRISPR的基因传递来证明了这个原理。临床可行性已被证实，通过将CD19-CAR特异地传递到PD-1位点，引发了NHL中的高CR率，尽管这个制造过程并未能满足相当大一部分患者的剂量要求。改良DNA模板和小分子抑制剂混合液正在提高基因插入的效率和细胞产量。转座子基因传递方法也已经被使用，然而有两个病例报告使用Piggybac转座子平台进行高拷贝数的整合后，CAR工程T细胞发生了恶性转化。体内基因传递是一种新兴的方法，能提高可访问性并降低成本。在这种方法中，DNA或RNA通过病毒载体或纳米颗粒进行系统性传递，这些纳米颗粒能优先靶向并在体内转化免疫细胞群。但是，由于病毒载体可能引发中和抗体，其免疫原性可能限制其重复使用。已经证明，在小鼠中使用靶向CD3的脂质纳米颗粒可以稳定表达CD19-CAR，而且含有优化RNA的T细胞靶向脂质纳米颗粒在小鼠模型中减少了心脏纤维化。
用于非恶性疾病的CAR疗法
虽然CAR T细胞平台已经被优化用于癌症治疗，但是应用于CAR T细胞的设计原则和广泛的合成生物学工具箱为将此治疗方法扩展到包括自身免疫性疾病、衰老、纤维化和传染性疾病在内的非恶性疾病提供了可能性。在临床前研究中，CD19-CAR T细胞已在系统性红斑狼疮中显示出有益效果，且有病例研究报告了CD19-CAR疗法在一个难以治疗的狼疮性肾炎患者中的持久效果。嵌合型自身抗体受体（CAARs）是原型CARs，它们中包含针对自身反应性B细胞克隆的特异性决定簇（idiotype）的scFv，或者使用自身抗原作为识别领域。临床前研究中，CAARs已在天疱疮治疗中展示了疗效，临床测试也正在进行中。采用调节性T细胞（Treg细胞）作为替代方法来治疗自身免疫性疾病，这种细胞主要发挥抑制作用，而非毒杀作用。非工程化的Treg细胞在移植物抗宿主病（GVHD）、异种移植、1型糖尿病、系统性红斑狼疮和多发性硬化症的小鼠模型中已经表现出了活性，早期临床数据也显示了这种方法的可行性和良好的安全性。与非工程化细胞相比，表达针对疾病组织上表达的抗原的CAR的Treg细胞显现出了更强的特异性和效能。最近的研究数据显示，无意中扩展CAR Treg细胞的数量已经限制了商业CAR T细胞的效果，这为CAR工程化Treg细胞的实用性提供了原理验证。目前，人们正在尝试通过工程化FOXP3表达来强化其谱系稳定性，并引入安全开关以减少相关风险。在血友病小鼠的最新预实验数据中，研究人员发现表达了针对因子VIII的CAR和FOXP3的Treg细胞能够阻止中和抗因子VIII抗体的产生。此外，针对尿激酶型纤溶酶原激活物受体的衰老细胞杀伤CAR T细胞已经被证明能在体外靶向衰老细胞，并在肝纤维化模型中恢复组织的稳态。针对成纤维细胞活化蛋白（FAP）的CARs在心脏纤维化的小鼠模型中已经提高了心脏功能，并且利用装载有mRNA的CD5导向脂质纳米粒子在体内生成的FAP-CARs也显示出有益效果。在这个模型中，mRNA的非整合特性确保了CAR表达是暂时性的，因此减轻了因广泛清除活化成纤维细胞所带来的毒性风险。
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