文献
2023
Genome Biology
Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of stem cell niche in cotton lateral meristem
课题背景
植物体细胞胚胎发生是一种将各种组织的体细胞体外培养，经历脱分化和再分化形成体细胞胚胎的过程。关于体细胞胚胎起源于外植体组织中的单个细胞还是多个细胞，以及控制细胞重新编程以启动胚胎发育的机制，目前的研究仍然有限。
棉花是研究体细胞胚胎发生的重要模型，它可以产生胚胎发生愈伤组织（EC）和非胚胎发生愈伤组织（NEC）。影响棉花体细胞胚胎发生的主要因素是外植体基因型。目前，只有极少数基因型，如Coker 201/310/312/315，ZM24，Simian 3，YZ1和 Jin668，通过体细胞胚胎发生展现出较高的再生效率。在这些基因型中，Jin668在遗传工程和基因编辑中被广泛应用。然而，其强大的再生能力机制尚不清楚。
近年来，体细胞胚胎发生的形态和分子机制已成为研究的新焦点，转录因子被认为在其中起着重要的调控作用。某些关键转录因子已被用于提高植物再生效率，其中包括BBM、EMK、SERF1、WIND1、WIND2、WIND3、WIND4 、WUS2、AGL15、LEC1、LEC2 、FUS3、GRF-GIF、STM、KN1、ESR1、ESR2以及MP等。除了转录因子，其他蛋白编码基因和表观遗传调控也调节体细胞的重编程过程。在棉花中，GhHmgB3 、GhCK、GhL1L1 和 GhTCE1 调节脱分化过程。在棉花中，体细胞胚胎发生期间的基因调控细节以及基因型依赖的再生过程仍然未知。
先前的研究表明在使用棉花下胚轴段作为外植体进行农杆菌介导的转化时，农杆菌主要侵染初生维管组织。尽管植物细胞具有很高的再生潜力，但这一过程的时空限制也与干细胞、分生组织细胞或高度可重编程细胞的位置密切相关。因此，准确的分析体细胞在单细胞水平上的重编程过程，对于改善我们对植物再生调控机制的理解具有巨大的潜在价值。
单细胞转录组测序的迅速发展为在单细胞水平鉴定基因表达模式和解析体细胞胚胎发生的调控网络提供了前所未有的机会。拟南芥根的单细胞景观显示出高度异质性，不同细胞簇中存在不同的离子吸收和激素反应模式。从水稻和拟南芥根的scRNA-seq数据比较分析表明，大多数细胞类型的转录组差异很大，强调了对物种特异性组织进行单细胞分析的重要性。
亮点
为了探索组织培养中棉花下胚轴初生维管组织的转录动态，作者在愈伤组织诱导后的0、1、6和12小时，使用棉花栽培品种TM-1（难再生）和Jin668（再生能力强）进行了scRNA-seq分析。并且利用基因编辑技术和转基因技术，对scRNA-seq鉴定出的LAX2、LAX1和LOX3基因的作用机制进行了解析。总的来说，这项研究以单细胞分辨率提供了棉花下胚轴不同细胞类型的转录组景观，并确定了调控植物再生的候选基因。
结论1 棉花下胚轴去分化过程中单细胞转录图谱
Fig 1a-b
下胚轴是农杆菌介导棉花遗传转化的主要外植体（Fig 1a-b），之前的研究已经表明，农杆菌主要在棉花下胚轴的初生维管组织中表达转化的基因，然后通过体细胞胚胎发生产生稳定转化的愈伤组织和再生植株。
Fig 1c-d
下胚轴维管束的形成层呈环状排列，这是双子叶植物的典型特征（Fig 1c）。在19℃下与农杆菌共培养48小时后，Jin668和TM-1的下胚轴原生维管组织中均能检测到在CaMV-35S启动子的转录调控下表达的GFP和RFP（Fig 1d）。转基因表达主要在两个基因型的相同组织中观察到，这表明棉花下胚轴的初生维管组织最有能力表达转基因，可能是因为它的代谢和转录活性更高，或者细胞质密度更大。
Fig 2a
作者使用scRNA-seq技术，对愈伤组织诱导前后的Jin668和TM_1进行了分析。在四个时间点（培养0、1、6和12小时）获得了单细胞的原生质体，每个时间点有两个独立的重复（Fig 2a），使用10 × Genomics的scRNA-seq平台对每个样品约100,000个原生质体进行单细胞转录组测序。
Fig S1b
经过细胞和基因水平的质控，获得了Jin668的30,357个细胞和TM-1的29,234个细胞，两个生物学重复之间一致性较好（Fig S1b）。
Fig 2b-c
为了进行后续的细胞聚类和注释，每个样本的两个生物学重复被合并，利用UMAP进行降维（Fig 2b-c）。
Fig 2d-e
从PsctH获取植物中典型的marker基因以进行细胞类型的注释。对于Jin668（命名为Jin0到Jin8）和TM-1（命名为TM0到TM8）的每个细胞簇，选取了前50个marker基因，用于匹配细胞类型。marker基因的拟同源基因被鉴定并用于注释这些细胞簇（Fig 2d）。通过这一策略，大致确定了Jin668和TM-1下胚轴的主要细胞类型，包括表皮、皮层、木质部导管、初生木质部、初生韧皮部、形成层和薄壁组织。
为了确认细胞簇分类的准确性，作者选择了在Jin668和TM-1中都表达的基因作为RNA原位杂交的marker基因。其中，Ghir_A01G019320和Ghir_A10G018730是新鉴定的marker基因，分别在棉花下胚轴的初生木质部和初生韧皮部中表达（Fig 2e）。此外，一些在Jin668细胞簇中富集的基因也在TM-1的相同位置表达。这些数据表明所鉴定的细胞类型是正确的，并且Jin668和TM-1具有类似的细胞类型。
结论3 棉花下胚轴的初生维管细胞是体细胞胚胎发生过程中启动细胞重编程的主要细胞类型
Fig 3a-b
不同细胞类型在愈伤组织诱导过程中如何对外部刺激作出反应？
为了解答这个问题，作者将TM-1和Jin668的所有单细胞数据合并（称为Cotton），使用t-SNE和UMAP进行聚类，并对这些细胞类型进行了注释（Fig 3a）。为了进一步表征这些细胞cluster，作者鉴定了同种细胞类型的差异表达基因。
通过韦恩图发现在所有主要细胞类型中（包括表皮、皮层和原生维管组织），TM-1和Jin668之间有超过80%的类似表达基因（Fig 3b）。韧皮部筛管是个例外。
Fig 3c-d
为了识别参与体细胞胚胎发生的细胞类型，作者在合并的细胞簇中检查了与生长素合成、生长素响应、伤口诱导、细胞分裂素和表观遗传调控相关基因的表达模式（Fig 3c）。对于这些基因，发现它们在初生维管组织（Cotton2、Cotton3和Cotton8）中高表达。例如，生长素运输蛋白LAX2是一种用于调控维管纹理的基因，主要在被鉴定的Cotton3（薄壁细胞）中表达。伤口响应家族蛋白WIP1、IAA转录调控家族蛋白IAA4和乙烯应答元素结合蛋白EBP在Cotton2（原生木质部）高表达，但在成熟木质部（Cotton6）不表达。
然而，另一个生长素响应家族蛋白基因EFE在Cotton5簇（皮层）中富集，而生长素运输蛋白基因AUX1在Cotton8（形成层）中活跃。通过组织学切片证明下胚轴形成层在培养基诱导3天后开始增殖（Fig 3d）。这些结果表明，初生维管组织，尤其是形成层和维管薄壁组织，在愈伤组织诱导过程中是对激素诱导作出响应的主要区域。
结论4 Jin668下胚轴的初生维管细胞呈现出不同的生长素响应基因表达模式
Fig 4a
TM-1和Jin668之间细胞cluster的相似性促使我们探究单细胞转录组的保守性和异质性。为此，作者在相同的细胞类型、相同的诱导时间下，比较了Jin668和TM-1的基因表达谱，以进一步了解细胞命运向胚胎发育的转变。
在表皮、皮层、和韧皮部中，差异表达基因 (DEGs) 大多与各自细胞类型的功能相关。在原生木质部中，约1%的DEGs、薄壁细胞中约1%的DEGs以及形成层中约2%的DEGs与植物再生有关。其中，许多基因与激素响应有关，包括ACT3、EMB2448、ERS和EBP（Fig 4a）。这些细胞类型是在愈伤组织诱导早期阶段经历命运转变的主要细胞类型。
Fig 4b
为了更好地理解Jin668和TM-1的木质部和薄壁细胞内基因的时空表达模式，作者比较了四个时间点的基因表达趋势。由于Jin668可以实现再生而TM-1不能，所以重点关注了在相应基因型的细胞簇中表达趋势相反的基因。
伤口诱导基因WIND1和ANAC071在Jin668和TM-1中均表达。其中，WIND1主要在薄壁细胞和形成层细胞中表达，在Jin668中上调，在TM-1中下调。而ANAC071在Jin668和TM-1的原生细胞中有不同的表达趋势。生长素响应相关基因AHL15、LBD16、LBD18和LBD19，生长素响应因子ARF19和E2Fa，以及生长素转运相关基因TET3在原生木质部和薄壁细胞簇中表达。TET3主要在薄壁细胞中表达，在Jin668和TM-1中的趋势完全相反。
AUX1/LAX依赖的生长素内流在早期胚胎发生后就对细胞形态的形成起重要作用。作者发现LAX2只在形成层细胞中表达，并在Jin668和TM-1中呈现出明显不同的表达模式（Fig 4b）。
Fig 4c-d
为了识别在Jin668中特异表达的基因，作者比较了Jin668和TM-1的数据，获取了特异在Jin668原生木质部、形成层和薄壁细胞中表达的基因（Fig 4c-d），然后对这些基因进行功能注释。
在初生木质部中，鉴定出81个在Jin668中特异表达的基因，包括细胞分裂素代谢相关基因CKX3、脱落酸生物合成基因ICE1、生长素合成相关基因PLC2和生长素极性转运基因PIS1。在Jin668的形成层区域，检测到生长素相关基因MYB44、MYB73、CSEF、PIS1，乙烯响应相关基因RAP2.11、PDR12、FER，伤口响应基因Ghir_D12G014280、Ghir_A06G021760。
有趣的是，与生长素转运相关的基因在Jin668的这三种细胞类型中均下调（Fig 4c-d）。鉴于Jin668中的生长素内流基因AUX/LAX富集且上调，生长素的极性运输和分布可能在经历重分化的细胞中非常重要，而这些Jin668细胞在诱导条件下更有可能产生愈伤组织并形成体细胞胚胎。
结论5 愈伤组织诱导过程中下胚轴维管细胞连续分化轨迹的重建
Fig 5a-b
单细胞转录组能够帮助我们探索愈伤组织诱导过程中细胞的发育轨迹。前面提到，与细胞命运转变相关的基因在初生维管组织中富集（Fig 3c）。为了构建愈伤组织诱导过程中下胚轴维管细胞的重建轨迹，作者使用Monocle2对代表这些细胞类型的簇进行了伪时序分析。通过使用薄壁细胞、形成层和原生木质部的数据，展示了不同分支的发育状态。在Jin668中，分化始于形成层和薄壁细胞，原生木质部和木质导管前体分别分为不同的分支。这些状态分别命名为JPC（Jin668薄壁细胞/形成层）、JPX（Jin668原生木质部）和JXV（Jin668木质导管前体，Fig 5a）。TM-1的轨迹分化与Jin668类似，起始分支是TPC（TM-1薄壁细胞），最终分支是TPX（TM-1原生木质部）和TXV（TM-1木质导管前体，Fig 5b）。
Fig 5c-e
生长素的空间分布对于形成层的维持至关重要。GO富集分析发现，伪时序分析的起点主要富集到与“生长素外流”、“生长素极性转运”和“生长素跨膜转运器活性”相关的GO term（Fig 5e）。生长素转运相关基因WAT1和IAA4在Jin668和TM-1细胞簇的分支起点富集，支持生长素转运参与调节形成层细胞活性的观点（Fig 5c-d）。
作者在Jin8和TM3中鉴定出显著更多的DEGs。值得注意的是，生长素内流载体基因LAX1，和LAX2仅在Jin668的起始分支中表达，这表明在愈伤组织诱导过程中，Jin668和TM-1的形成层细胞在生长素分布模式上可能存在差异。
在体细胞胚胎发生过程中，生长素在体胚极性的建立中扮演重要角色，生长素转运相关基因影响体细胞获得胚性能力。生长素极性转运基因PIN1主要分布在轨迹的初始分支和初生木质部。这意味着这些细胞之间的生长素流动可能会发生动态变化，生长素的分布可能会影响细胞命运。为了探索不同组织的分化轨迹，作者进一步研究了XV（木质导管前体）和PX（原生木质部）分支之间的基因表达模式差异。结果显示，在XV分支中，无论是TM-1还是Jin668，在“木质素代谢”、“次生细胞壁生成的调控”和“植物细胞壁”的富集都表明这些细胞类型正在经历细胞壁增厚和木质化过程（Fig 5e）。有趣的是，JPX和TPX中优先表达的基因富集在“侧根发育”、“侧根形态发生”、“对生长激素的响应”、“生长素激活信号通路”和“细胞对生长素刺激的响应”等GO term中 。在最终的细胞状态中，存在受伤诱导的细胞响应，包括ROS、乙烯和茉莉酸（JA）相关基因的积累。因此，作者推测在体胚发生过程中，较少分化的细胞（如形成层细胞），更有可能经历脱分化形成愈伤组织并获得胚性能力。此外，作者还分析了可能影响两个基因型中脱分化的DEGs。与TM-1相比，生长素相关基因PIN3、AFB2、ATHB2以及CSEF在Jin668的JPX中显著高表达，暗示这些基因可能参与了木质部细胞的脱分化（Fig 5e）。
总的来说，作者认为愈伤组织主要起源于初生木质部细胞，形成层细胞可能在维持生长素平衡方面起重要作用。初生木质部和形成层细胞之间可能存在密集的细胞间通信，这影响了愈伤组织的形成和植物再生过程。
结论6 RNA速率分析描述了棉花下胚轴向初生木质部细胞的转变
Fig 6a-b
RNA速率分析可用于量化组织培养过程中的细胞转变，并揭示Jin668和TM-1中的调控基因。
在Jin668中，RNA速率分析鉴定到一个明显的向初生木质部细胞的流动，而在TM-1中，流动朝向初生木质部和表皮细胞（Fig 6a）。如预期所示，前形成层细胞趋向于初生木质部细胞，并横跨薄壁细胞（Fig 6b）。AUX-IAA基因ARF5和GH3.17（Fig 6b）显示出从形成层细胞到初生木质部的正向流动，暗示它可能在激素诱导下引导木质部细胞形成愈伤组织的过程发挥重要作用。有趣的是，成熟的细胞类型，如木质部和韧皮部，也表现出向前形成层发展的趋势（Fig 6b），与脱分化过程一致。
Fig 6c-d
此外，作者发现在这一过程中，SAUR51表现出最明显的变化，表明其在木质部和韧皮部细胞脱分化中发挥了作用（Fig 6c）。相反，在TM-1中，薄壁细胞/形成层区域的流动趋向于初生木质部。与胚胎发育相关的基因EMB2739和与根发育相关的基因Ghir_A10G019630在最终状态下表达，这意味着TM-1的初生木质部最终可能分化为根细胞，而不是愈伤组织或体细胞胚胎（Fig 6d）。
总的来说，RNA速率分析和伪时序分析为棉花下胚轴组织培养过程中细胞类型发展和基因表达的重构提供了新的见解。
结论7 基于scWGCNA揭示维管细胞分化和植物再生
Fig 7a-b
细胞的功能单位更有可能是通路而不是单个基因。为了系统地研究Jin668和TM-1中的基因动态调控，作者进行了WGCNA。WGCNA检测到Jin668的69个基因模块和TM-1的60个基因模块（Fig7a-b），每个模块包含一组在特定细胞类型中倾向于共同表达的基因。
作者发现，与分生组织维持以及胚胎极性建立相关的STM在Jin668的薄壁组织模块的调控网络中特异性表达，这些基因对于胚胎极性的建立至关重要。
Fig 7c-f
此外，在Jin668的薄壁组织模块中，STM与和与生长素相关的LBD25存在共表达（Fig 7c），这再次暗示着Jin668和TM-1存在不同的生长素极性网络。
在Jin668的初生木质部中，WOX13和DTA4共同表达，而在TM-1中则不存在共表达（Fig 7d）。
与生长素运输相关的基因AUX1、LAX2以及WAT1在Jin668的形成层细胞中处于同一共表达网络中（Fig 7e）。在TM-1的相同细胞类型中，LAX2和与生长素极性运输相关的基因MDR1位于同一共表达网络中（Fig 7f）。这些数据表明，在Jin668和TM-1中，不同的基因参与了生长素的调控，进一步证明了Jin668和TM-1细胞在组织培养过程中具有不同的生长素运输特性，这与不同的细胞命运相关。
结论8 通过CRISPR/Cas9基因敲除和过表达验证三个候选基因
Fig 9a-c
整合上述分析，作者挖掘到一系列潜在的促进再生的基因，最终选取了GhLAX1、GhLAX2和GhLOX3进行实验验证。
为了研究LAX在棉花再生中的作用，作者创建了GhLAX1的CRISPR/Cas9敲除系（CR1）和GhLAX2的过表达系（OE1，Fig 9a）。在愈伤组织诱导培养基上培养3天后，下胚轴外植体的两端开始扩展。组织切片显示，空载对照组织（P7N）的初生导管组织细胞明显大于基因敲除组织（Fig 9b）。与JP7N（Jin668 P7N对照）和TP7N（TM-1 P7N对照）相比，JCR1（Jin668 CR1敲除）和TCR1（TM-1 CR1敲除）外植体的初生导管组织细胞增殖明显受抑制，诱导10天后，初生导管组织产生的愈伤组织显著少于对照。相反，过表达植株JOE1（Jin668 OE1）和TOE1（TM-1 OE1）显示出明显的初生导管组织细胞增殖（Fig 9b）。
虽然所有外植体在诱导20天后都产生了愈伤组织（Fig 9c），但愈伤组织的增殖率（CPR）在20天的诱导后表现出显著的差异：JCR1的CPR为58%，JOE1为130%，与Jin668中的对照组（88%）显著不同（t检验，P < 0.05），这表明这些LAX基因可能在Jin668的愈伤组织增殖中发挥重要作用。
Fig 9d-f
诱导约70天后，TOE1和JOE1产生了软黄色的愈伤组织，该愈伤组织中的细胞呈圆形，细胞质浓密，这是胚胎形成性棉花愈伤组织的典型特征。与对照外植体（JP7N）相比，TOE1和JOE1都产生了更多的胚胎愈伤组织。然而，JCR1和TCR1的大部分愈伤组织都是硬的且呈绿色，愈伤组织细胞形状不规则、细胞质较薄，这与TP7N对照愈伤组织有很大不同（Fig 9d）进一步，作者统计了这些转基因材料体外细胞胚胎形成的时间。与对照相比，过表达材料可以在较短时间内直接从愈伤组织中诱导体外细胞胚胎，且体外细胞胚胎的形态正常（Fig 9e-f）。
机械损伤是愈伤组织诱导的一个触发因素，而植物激素茉莉酸（JA）是植物对环境胁迫作出反应的关键调节因子。作者发现一个参与JA生物合成的酶的编码基因LOX3，在Jin668中特异性表达而在TM-1中未表达。在Jin668中敲除GhLOX3（CR2）会减少原始导管组织的增殖，但与对照组P7N相比，无论是在Jin668还是在TM-1中，CPR并没有显著减少（Fig 9b-c）。这意味着GhLOX3和JA在愈伤组织诱导中可能发挥了较小的作用，而LAX基因通过调节生长素运输对胚胎潜能有更大的影响。
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