第一节 显微镜检查
微生物细胞含大量水分（一般在80%~90%以上），绝大多数必须染色，才能显微镜观察。
一、染色
（一）染色的基本原理
借助物理因素和化学因素的作用进行
物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透和吸附作用
化学因素：细胞物质和染料的不同性质发生各种化学反应
细菌的等电点较低，pH在2~5之间，故在中性、碱性、弱酸性溶液中，<u>菌体蛋白质</u>电离后带负电荷；而碱性染料电离时<u>染料离子</u>带正电。
所以，细菌学上常用碱性染料染色。
染色操作程序：<u>制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检</u>
（二）染色方法
- 单染色法 一种染料、但不能鉴别微生物
- 复染色法 两种or两种以上、协助鉴别微生物。亦称鉴别染色法。
- 单染色法
一种染色剂、简便易行、适于形态观察。
常用碱性染料。使用酸性染料时、必须降低染液的pH，使其呈现强酸性（低于菌体等电点），让菌体带正电荷、才易于染色。
- 石炭酸复红染色液：着色快、时间短、菌体红色
- 美蓝染色液：着色慢、时间长、效果清晰、菌体蓝色
- 草酸铵结晶染色液：染色迅速、着色深、菌体紫色
- 革兰染色法
广泛使用的鉴别染色法、1884丹麦Gram创立。
碱性染料（草酸铵）结晶紫染色、碘液媒染、<u>95%酒精</u>脱色、碱性番红 复染。
初染、媒染、脱色、复染四个步骤。（G+菌体紫色、G-红色）
- G+：有芽孢的杆菌、多数球菌、放线菌、真菌
- G-：弧菌、螺旋体、多数致病性无芽孢杆菌
主要依据：
- G+含有<u>核蛋白质镁盐与多糖的复合物、与碘和结晶紫的复合物结合很牢、不易脱色。</u>
- G+菌体<u>等电点比G-低</u>，相同pH下染色、<u>吸附碱性染料很多，因此不易脱去</u>。
- 两类菌细胞壁对<u>结晶紫-碘复合物的通透性</u>也不一致，G+透性小，故不易被脱色。
- 抗酸染色法
<u>分枝杆菌属、细胞壁含大量脂质</u>。
着色后抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，又称<u>抗酸杆菌（acid-fast bacilli）</u>
分枝杆菌-红色、其他细菌&背景-蓝色 - <u>5%石炭酸复红染色剂</u>盖满痰膜，微火加温→蒸汽，去火焰，<u>染色5~10分钟</u>，水洗
- 加<u>5%盐酸酒精脱色剂</u>盖满痰膜，<u>脱色3~5分钟</u>，至无红色、水洗
- 加<u>美蓝复染剂</u>、（直接涂片30秒、集菌涂片1~3分钟）、水洗、干后镜检。
- 芽孢染色
<u>孔雀绿 加热条件下</u>染色，染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料水洗后脱色、进入芽孢的染料很难被水洗脱色，复染剂染色后、芽孢保留初染剂颜色、菌体和芽孢囊被染成复染剂颜色。
芽孢染色操作步骤
制成菌悬液→<u>孔雀绿染色1分钟</u>→试管水浴<u>加热1520分钟</u>→接种环取加热染色菌液涂片→干燥→固定→<u>水洗**脱色**</u>→<u>**番红或稀释石炭酸复红**复染12分钟</u>→水洗→晾干→油镜观察 - 荚膜染色
采用负染色法染荚膜、湿墨水法（较简便、适用广）
荚膜不着色、在菌体周围呈一透明圈。
由于荚膜含水量在90%以上，染色时不加热固定，以免荚膜皱缩变形。 - 负染色法
- 制片：载玻片、蒸馏水1滴、少量菌体混匀涂布
- 干燥：晾干or电吹风冷风吹干
- 染色：复红染色液染色2~3分钟
- 水洗
- 干燥
- 涂黑素：一小滴黑素、推片向右一拖、使黑素在染色涂面上成为一薄层、风干
- 镜检：先低倍镜→再高倍镜
背景灰色、菌体红色、荚膜无色透明。
- 湿墨水法
- 制菌液：加一滴墨水、少量菌体混合
- 加盖玻片：放一盖玻片于混合液上、在盖玻片上放一张滤纸、轻压 吸去多余菌液
- 镜检
背景灰色、菌体较暗、在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
- 鞭毛染色
基本原理：染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上、使鞭毛直径加粗、然后再染色。常用<u>镀银法染色</u>。
步骤-简略：
- 媒染(A)液：饱和硫酸铝钾、5%FeCl3、黑色溶液
- 媒染(B)液：5%AgNO3
制片：1滴蒸馏水、少许菌苔、平放干燥
染色：A液染35分钟→蒸馏水冲洗→残水沥干or用B液冲去残水（**充分洗净A液、否则背景很脏**）→滴加B液→酒精灯上稍加热、微冒蒸汽而不干、3060秒→蒸馏水冲洗、自然干燥
镜检：菌体深褐色、鞭毛为褐色
二、显微镜检查
（一）普通光学显微镜
油浸物镜、观察完毕、<u>先用擦镜纸</u>擦去镜头上的油、在用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液（乙醚2份、无水乙醇3份）or二甲苯，擦去残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下（朝一个方向）
普通光学显微镜<u>不能观察细胞和细菌的亚结构。</u>
（二）暗视野显微镜（未染色活细胞、运动、不能细微结构）
设计原理：丁达尔现象
光源的中央光束被阻挡、散射的光线投入物镜、整个视野是黑暗的。
暗视野中观察到的是被检物体的衍射光图像、并非物体本身、所以只能看到物体的存在和运动，（不能辨清物体的细微结构）。用于→未染色标本的<u>活的</u>细菌、真菌，并可观察活细胞内的线粒体及细菌鞭毛的运动。观察螺旋体时多用暗视野显微镜。
暗视野聚光器→显微镜的聚光器支架上、显微镜灯照明，聚光器和标本片之间要加一滴<u>香柏油</u>。目的：避免聚光镜全反射。
（三）相差显微镜（活细胞、细微结构）
将光线通过透明标本细节产生的光程差（相位差）转化为光强差的特种显微镜。
适用于对<u>活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构</u>的观察。
放上绿色滤光片
（四）荧光显微镜
高发光效率的点光源→滤色系统→一定波长的光<u>（紫外光365nm、紫蓝光420nm）作为激发光</u>→激发标本内的荧光物质发射出荧光。
敏感性高、用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光光源一般采用超高压汞灯（50~200W）、激发滤片（紫外、紫色、蓝色、绿色）、阻断（或压制）滤光片
按光路区分
- 透射式荧光显微镜 激发光源通过聚光镜、穿过标本、放大倍数↑荧光↓
- 落射式荧光显微镜 激发光从物镜落射到标本表面、放大倍数↑荧光↑
第二节 病原细菌分离
一、传统细菌分离方法
传统细菌：指人工培养基上易于增殖的细菌
（一）标本的分离前处理
- 增菌
- 冷增菌 耶尔森-低温下不停止繁殖、4℃
- 加热 芽孢杆菌耐热-炭疽芽孢杆菌、沸水浴15 mins
（二）平板划线分离技术
“三段划线”、目的：使细菌分散、生长为单个菌落、便于挑选目标细菌
（三）分离培养基选择
- 高营养培养基or敏感培养基
目的：为目标细菌提供尽可能完整的营养条件、促进繁殖
氨基酸、糖类、无机盐类、补充营养物质 - 鉴别培养基
常用鉴别物质： - 染料
- 特殊的糖、醇类物质加酸碱指示剂
- 显示目标细菌特殊代谢产物的化学反应试剂
- 选择培养基
充分支持目标细菌生长、尽可能抑制杂菌、特别是限制呈“匐行性”生长的杂菌（变形杆菌、真菌）
选择手段： - 限制培养基中的营养成分、采用特殊生长条件：对营养要求低、条件特殊的致病菌。（霍乱弧菌--碱性蛋白胨培养基）
- 加入抑菌成分：龙胆紫、胆盐等
- 加入抗生素：多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素
（四）菌落识别与挑取
- 菌落的肉眼形态
炭疽--灰白色、磨砂玻璃状；鼠疫：生长慢、灰黄色、隆起 - 细菌的显微形态
**炭疽：狮鬃样菌落；鼠疫：表面粗糙的颗粒状突起、血琼脂平板-边缘带有“花边”；支原体--“荷包蛋”状 - 挑取菌落
第二次纯分/进一步培养鉴定
二、难培养细菌的分离
类型：
- 营养要求高，或需特定成分（如支原体）
- 需要特殊温度、湿度、pH和气体条件
- 生长特别缓慢、培养过程中防止杂菌污染和过度生长难度较大
（一）厌氧菌分离
烛缸、严格的分离操作-处理标本开始无氧的手套箱
（二）支原体分离
使用特殊的培养基：添加胆固醇、马血清、酵母提取物、抗生素等。液体-添加酚红指示剂
固体培养基、5%CO2、37℃、7日后用60倍低倍镜 斜投射光观察是否生长、一般3周左右长成菌落。菌落中心陷入平皿生长、“油煎蛋”样
支原体菌落坚实、无法挑取、灭菌刀片切取菌落琼脂块→移入液体培养基→棕红色变为黄绿色提示生长、支原体小→液体培养不会明显浑浊
反复2~3次。
（三）L型分离
L型→细胞壁缺损的细菌
在普通渗透压下、细胞壁缺损的细菌会“涨破”死亡→分离L型的培养基必须高渗透压。
<u>琼脂浓度0.5%（0.30.5%半固体、1.5%2.5%固体）以下的半固体培养基，加马血清及10%蔗糖维持渗透压</u>（3%~5%NaCL？）L型可生长成“油煎蛋”样细小菌落。
（四）螺旋体分离
- 钩端螺旋体
血液标本→<u>Korthof或EMJH培养管、2030℃→57 d取培养物</u>暗视野显微镜下观察有无生长
克服杂菌污染，病人尿液、采集前一晚服用<u>碳酸氢钠（NaHCO3）2~4g，培养基中加入5-氟尿嘧啶or磺胺嘧啶</u> - 梅毒螺旋体
接种<u>兔睾丸or眼前房。氧浓度1.5%、含有棉尾兔上皮细胞的组织培养基、34~35℃</u>。
（五）立克次体分离
专性细胞内寄生菌、必须动物及细胞分离
姬姆尼茨、吉姆萨染色
- 通过动物分离
除<u>恙虫病选小白鼠、其他立克次体雄性豚鼠</u>。 - 使用鸡胚分离
<u>5~7日龄鸡胚、卵黄囊</u> - 细胞培养
<u>Vero、L929细胞</u>、37℃、5%CO2
三、使用动物的分离方法
常用动物：小鼠、大鼠、豚鼠
注射：皮下、腹腔、静脉or特殊器官（如颅内接种）
已分离的病原菌在保存过程中突变→丧失致病能力→制成悬液<u>接种于动物→重新从动物分离出来→成为完整毒力的培养物</u>，过去是保存病原菌的常规做法→菌株的“复壮”（实际上是利用动物的疾病过程，将残留的具有毒力的致病细菌从大量无毒力的突变细菌中重新分离出来）
第三节 病原细菌鉴定
一、生化特征鉴定方法
二、特殊反应鉴定方法
最常用-革兰染色、特殊反应-荚膜肿胀试验等
三、噬菌体鉴定方法
霍乱弧菌鉴定：噬菌体-生物学分型
四、其他特殊的鉴定方法
单克隆抗体检测特异性抗原：凝集试验、ELISA、免疫荧光试验、胶体金免疫吸附试验等
五、分型
最常用实验同四
六、特异性核酸片段鉴定
比抗原检测敏感性更高
- 聚合酶链式反应→PCR：普通PCR、套式PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR
- 探针杂交
- 基因芯片杂交
七、病原毒力测定
通常使用动物试验。半数致死量为指标。
第四节 分离后细菌的培养和保存
一、纯分后细菌的培养方法
每一次分离过程、获得的纯培养物→称作一“株”该种细菌
所保存的培养物→称为该种细菌的“菌种”。
将细菌增殖到所需数量→这一过程称为“培养”。
- 细菌数量不大时，固体or半固体培养基
- 用于遗传学鉴定：特别强调从单独菌落开始，固体的平板培养基
- 一般的细菌鉴定：常用斜面。
- 短期保存培养物：高层？？半固体培养基→试管→接种针穿刺到琼脂培养基内。不容易干燥、不容易污染
- 提取细菌成分，需要较大培养量
- 固体培养基、<u>在“茄瓶”or“克氏瓶”中进行、一种放大了的斜面。</u>
- 液体培养基、烧瓶中振荡培养、需氧细菌使用较大烧瓶、<u>培养基只占烧瓶容量的10%~15%</u>，气体充分交换。
- 大量培养、使用“发酵罐”：一定容积的培养液、最大数量的细菌
恒温加热、配有加液口、搅拌器、通气管道
二、菌种保存方式
-
早期--传代
-
目前--多数采取“冻干”，<u>至少保持20年</u>。稳定剂：脱脂乳or蔗糖
缺点- 一支只能使用1次
- 冻干的菌种，必须经过“复苏”。（第一次培养时总是生长不良，至少一次传代）
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低温保存 稳定剂：甘油
<u>不可使解冻、几乎永久性保持、即作保存菌株又作工作菌种</u>- -20℃ 缓冲液加甘油60%浓度、呈黏稠的液体状，常规挑取
- -80℃ 加15%~20%甘油、冻结成硬冰激凌状、竹签刮取冰屑
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