蛋白质翻译后修饰(PTMs)是植物对环境变化反应最快、最早的一种响应方式，其机制和动力学研究是植物科学的一个非常重要的领域。其中目前研究最多的PTM之一是磷酸化修饰。Mut9样激酶（MLKs）是植物特异性核定位激酶家族，可磷酸化多种昼夜节律和光信号通路相相关的蛋白从而调控植物的生长发育。但目前对MLK激酶家族调控的各种信号通路和蛋白网络的理解较少。
2021年，Molecular & Cellular Proteomics(IF 5.911)在线发表了一篇题为“Quantitative Proteomics and Phosphoproteomics Support a Role for Mut9-Like Kinases in Multiple Metabolic and Signaling Pathways in Arabidopsis”的文章，该文章利用蛋白组学和磷酸化蛋白组学发现了MLKs的缺失会改变硫代葡萄糖苷酶的丰度和代谢、增加植物对紫外线辐射和DNA损伤剂的敏感性，从而确定了这些激酶在调节植物次生代谢和应激反应中的新作用。
研究材料
拟南芥WT和mlk突变（mlk1/2/3及mlk1/3/4）幼苗
技术路线
步骤1：mlk突变体幼苗的蛋白质组学分析；
步骤2：mlk突变体幼苗的磷酸化修饰质组学的分析；
步骤3：显著差异磷酸化蛋白的motif分析；
步骤4：显著差异磷酸化蛋白的GO分析；
步骤5：mlk突变增加了植物对DNA损伤的敏感性。
研究结果
1. mlk突变体幼苗的蛋白质组学分析
作者利用TMT蛋白组学技术，分析WT、mlk突变（mlk1/2/3及mlk1/3/4）拟南芥幼苗中MLKs对蛋白质组动力学的调控作用（图1）。WT和mlk突变拟南芥幼苗分别在光照和黑暗条件下放置12 h，在关灯前(ZT12)和黑暗2小时后(ZT14)分别进行采样。
蛋白组学共鉴定到近50000个肽对应7500个蛋白，差异分析显示在两个时间点上，mlk1/2/3突变株（较于WT）中仅13个显著差异蛋白，mlk1/3/4突变株的显著差异蛋白数为110个（图2），结果表明mlk1/ 3/4突变对整体蛋白质组的影响大于mlk1/2/3突变。差异蛋白的GO分析结果表明mlk1/2/3 ZT12、mlk1/3/4 ZT12、mlk1/3/4 ZT14组的上调蛋白主要富集在GLS（硫代葡萄糖苷）生物合成和相关过程上，下调蛋白主要富集在GLS分解代谢过程中（图3）。
为了验证MLKs参与GLS代谢调节，作者在ZT12时定量分析GLS的水平峰值，结果表明在mlk1/2/3和mlk1/3/4突变体幼苗（与野生型相比）中，脂肪族GLSs的含量均有所增加且与GLS相关生物合成酶的丰度增加有关（图4）。
图1 TMT蛋白组学流程
图2 蛋白组学显著差异分析
图3 显著差异蛋白的GO分析
图4 mlk突变株幼苗含有较高水平的（met衍生的）硫代葡萄糖苷
2. mlk突变体幼苗的磷酸化修饰质组学的分析
作者采用TMT磷酸化的方式对WT和mlk突变体幼苗进行磷酸化组学分析，总共鉴定到23386个磷酸化位点（对应15222个肽段），修饰位点所在的氨基酸分布均以Ser居多（图5A）。差异比较分析结果显示相较于WT组，mlk1/3/4 ZT12、mlk1/3/4 ZT14的显著差异磷酸化肽段数分别均比mlk1/2/3 ZT12、mlk1/2/3 ZT14的多，由此证明在两个时间点上尤其是在Z12时，mlk1/3/4突变体对磷酸化蛋白组的影响大于mlk1/2/3突变体（图5B）。这一结果证明了mlk是以光依赖的方式调节磷酸化蛋白质组。
对两个时间点的差异蛋白的共有蛋白进行分析（图5C和5D），结果显示它们主要参与了基因沉默和染色质结构通路，但部分参与染色质结构的蛋白仅在两种突变体的ZT12时间点上发生了显著改变，由此说明MLKs参与调控基因表达，且可能通过调节光依赖的染色质结构。
图5 mlk突变体幼苗的磷酸化蛋白组学分析
3.显著差异磷酸化蛋白的motif分析
显著差异的磷酸化肽段进行motif分析，结果显示显著上调、下调的磷酸化肽段分别展示出多种不同的motif基序（图6A和6B），这些基序均与一些特定的激酶相关。这些基序的多样性，表明MLK家族激酶通过系统调控多种激酶信号网络影响了许多生物过程。
图6 显著差异磷酸化肽段的motif分析
4.显著差异磷酸化蛋白的GO分析
对mlk两种突变体在ZT12和ZT14的显著差异磷酸化蛋白的GO富集分析，发现在细胞成分（cc）类别中，与细胞核相关的条目均高度富集（图7A），结果表明MLKs主要定位在细胞核中。在生物过程（bp）类别中，与染色质修饰相关的通路及蛋白均被富集（图7B和7C），结果表明MLKs在染色质结果中发挥作用。
对mlk1/3/4 ZT12突变幼苗的显著差异磷酸化蛋白的GO富集分析发现主要分布在节律过程和/或昼夜节律的过程中，证明了mlk与光信号和昼夜节律调节有相关性。
图7 显著差异磷酸化蛋白的GO 分析
5. mlk突变增加了植物对DNA损伤的敏感性
由于ZT12时间点上的mlk1/3/4的缺失对整体蛋白组和磷酸化修饰组的影响最大，因此，作者针对mlk1/3/4 ZT12数据集中显著上调、显著下调的磷酸化蛋白分别做GO分析（图8）。结果发现下调蛋白的富集生物过程中包含细胞对DNA损伤刺激的反应条目。为进一步验证MLKs在DNA损伤反应中的作用，作者评估了突变体和WT幼苗对基因毒性试剂MMS和UV-C的敏感性。结果表明随着MMS水平的增加，幼苗重量逐渐减少、褪绿组织增多、生长发育受损，相较于WT组，突变体的敏感性更高（图9A-9D），暴露于多剂量UV-C辐照时，mlk突变体对紫外线诱导的DNA损伤也更敏感（图9E）。综上所述mlk突变体增加了对DNA损伤的敏感性。
图8 mlk1/3/4 ZT12显著差异磷酸化蛋白的GO分析
图9 mlk突变体对DNA损伤的敏感性
小编小结
在这项研究中，作者对WT和mlk突变体幼苗在两个不同时间点进行了深入的蛋白质组和磷酸化修饰蛋白组学的定量分析。结果显示MLK突变幼苗改变了硫代葡萄糖苷(GLS)代谢酶的丰度，以及参与一系列不同生物过程(包括RNA加工、染色质组织)的蛋白质磷酸化差异。此外，mlk也可能调控拟南芥的DNA损伤反应。
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