本文选自molecular cancer，https://doi.org/10.1186/s12943-020-01179-5，喜欢的朋友可以下载学习一下。
文前扫盲一波：什么是非编码RAN，什么EMT.
非编码RNA主要的来讲分为三类：miRNA,lncRNA,circRNA，真是不是一家人不进一家门，miRNA活了很多年了，现在基本快到末期了，长度比较短约18-22nt这样，但是巨丰富，含量巨多，在调控基因表达上几乎是无孔不入，体内存在比较稳定，受到RNAase影响小。lncRNA比miRNA长一点，大于200nt，功能上也很丰富，基本上蛋白可以行使的功能，它都具备（我一般认为它就是蛋白的二次元形式），只要把蛋白研究上应用的抗体转化成探针就可以等同于蛋白研究套路，circRNA就是环状的RNA，像是一条蛇咬着自己的尾巴，功能和lncRNA差不多，把环拆开不就变成大号miRNA了，还有这lncRNA的特征（WC,circRNA这么威武），circRNA存在于细胞内也是比较稳定的，毕竟带圈的奥迪总比条形的海马强。问题来了，非编码RNA的定义就能看出来他们是丁克一族啊，没有子嗣，本文说的这个蛋白是环状RAN编码的，你能信？内心万分期待啊。
EMT这个是上皮间质转化，做肿瘤的都应该懂，具体我就不做深入介绍了，反正意思就是上皮细胞之间表达一些蛋白可以促进细胞间粘附，这样的话细胞是不是结合的紧密，不容易脱落形成转移了，但是间质成分缺乏这些细胞间粘附，细胞形态变扁、变圆，形变能力增加，可以在间质内移动，这样的话细胞容易从原来的部位脱离了，到其他部位继续生长，这个细胞上皮属性减弱，间质属性增强的过程就是EMT，和肿瘤转移、细胞干性获得、耐药、血管形成等过程都有联系。（我是不是废话太多）
开始今天的文章阅读环节。摘要概览一遍，总体说了这么一个故事，首先，circFNDC3B(我简写成circF了)在他人的文章中报道过，而且有生物学作用，具体在结肠癌(CC)中的作用怎么样，作者就是说了这么一个问题，是不是验证一下在CC中circF的表达，低表达与生存期缩短相关（这个起到抑癌作用），circF能抑制CC细胞的增殖、侵袭和迁移。其次，作者又作了一个 LC-MS/MS分析（这不是液相分离质谱吗，我不懂），发现这个circF可以编码一个蛋白-circFNDC3B-218aa（姑且称为218aa），作者发现circF发挥作用是通过218aa（WTF，那你前面说circF的作用都是骗人的吗？内心受到作者魔法攻击）。体内实验表明，上调218aa对CC进展有抑制作用。最后作者神来之笔，不知道谁出的主意，做起了218aa和糖代谢的关系，然后就发现了218aa对snail有作用，然后得出了调节EMT的过程。（什么？？？喝口水平复一下我躁动的心，这个真是越来越引人入胜了呢）
正文开始了：如果想要了解一个东西对某一现象是否起到作用你该怎么办？首先要做到这个东西是存在的（存在即合理（这是对我们搞科研的说的啊原来，怪不得一直不懂））。作者在细胞系验证了一波。设计了两种引物，一种发散引物合成线状RNA,一种聚合引物合成环状RNA，然后作者用cDNA和基因组DNA进行PCR，NB实验验证了在只有发散引物在cDNA底物存在的时候可以合成circF。Sanger测序证实了circF首尾相接，而且circF来源于FNDC3B基因的外显子5和外显子6，在circBase数据库中也得到了证实（这个过程应该是以往文章做过的套路）。与线性形式相比，circF对RNase消化具有抗性，半衰期较长。进一步的荧光原位杂交（FISH）表明，circF主要定位于CC细胞的胞浆中，而且在细胞系和肿瘤组织中低表达，与预后不良相关。这是一篇典型的上来就做表型验证，然后再了解机制的文章，这种做法比较常规，即使机制没有做出来，至少可以用表型说明一些问题，具体机制可以测序、做质谱等高端实验辅助一下。（对于图A大家需要了解一下sanger测序的原理，这个图h我还以为什么高大上的分析结果，原来是测了一批标本，把表达量相比正常从高到低排了个顺序。对于为什么用gDNA作为模板，我也不清楚要说明什么问题）。
验证完细胞内circF的存在后下面就是验证功能了（gain and loss of function），这里作者验证了circF的同时还验证了产生circF的这段mRNA，过表达circF的时候，mRNA并未明显扩增（这里验证我觉得应该是两个目的：第一排除了circF和mRNA会有协同表达的问题， 第二，为后面发现新蛋白排除mRNA翻译蛋白的干扰），通过siRNA沉默circF的时候，也没有影响mRNA的产生（这里为什么是两种不同的细胞系，作者说明什么意思，难道在其他细胞系没有验证或者验证了表现不明显）。因为circF和mRNA有外显子5/6同源序列，这个siRNA靶向circRNA的时候不是也会靶向mRNA，这里肯定有我不太了解的地方，先来快速认识一下什么是circRNA，然后是产生及功能。学习完这两个链接基本上对circRNA有个大体映像了。
功能验证正式开始，对于增殖方面，作者用过表达和敲减RNA进行了CCK8、克隆形成、transwell、划痕实验（做增殖、迁移、侵袭常规的实验操作啊）。
功能还OK，应该找机制才对，如果这个课题给我做的话，我应该去找circF的靶标以及低表达的机制了，但是作者并没有，他们不知道是怎么了去circRNA Db找了一下这个circF的注释，发现了一个ORF，这个ORF可以编码218个氨基酸。我敢说这个circF必定包含“AUG”密码子，如果没有终止密码子，这个蛋白那不是快乐源泉，如果编码蛋白，必定有核糖体结合区域，这218个氨基酸的密码子长度比circF要长（你懂的）。然后作者就自己命名了这么一个蛋白（是不是需要验证一下这个蛋白是不是存在？）。5′-cap独立翻译需要一个内部核糖体入口位点（IRES），作者发现ORF中存在一个IRES（从+448到+524），还用双荧光素酶法验证了IRES在circF中的活性。
接下来就是验证这个蛋白是不是存在的环节了。作者用了四种不同的载体：Lv-vector；LvcircFNDC3B-flag：将标记的circFNDC3B序列克隆到CMV诱导表达载体中；LvcircFNDC3B-flag-mut：将标记有起始密码子突变（ATG→ACG）的circFNDC3B序列克隆到CMV诱导表达载体中。Lv-circFNDC3B-218aa：标记的circFNDC3B-218aa序列被克隆到CMV诱导的表达载体中。然后就是转染细胞了，发现转染第二种和第三种载体后，circF表达升高，而转染第四种细胞时 circF表达未见变化。转染载体后并没有对mRNA的表达产生什么影响。这里作者估计是为了表达了载体的表达效率，因为circFNDC3B-218aa并不circF的序列，所以通过RT-PCR进行扩增时不能扩增出来。哪个能扩增出蛋白来？留个小问题。
作者又来检测蛋白了，这个218aa和FNDC3B部分同源，这个抗体的作用域如果在这个同源的部分那么抗体是没法分别218aa和FNDC3B的，所以，作者用了不同的抗体，在转染LvcircFNDC3B-flag或Lv-circFNDC3B-218aa后约25kda检测到标记为circFNDC3B-218aa的蛋白。此外，以FNDC3B中间部分为靶点的FNDC3B抗体可检测到Lv载体和Lv-circFNDC3B-flag-mut转染细胞中的circFNDC3B-218aa，而Lv-circFNDC3B-flag或Lv-circFNDC3B-218aa转染细胞在25kDa处的circFNDC3B-218aa表达更为明显（这个通过条带的位置也可以区分一下吧！我只是这么觉得）。载体对FNDC3B的表达没有影响。然后作者用第二种载体转染的细胞又去打了个质谱分析，发现了这个蛋白，为了更明确这个蛋白的存在，作者又对218aa和FNDC3B同源的氨基酸抗体作了coIP，不管怎么说，确定了这个蛋白的存在。
质谱分析的结果我看不懂，能看懂的来解释一下
蛋白也有了，circF功能也有，是不是要验证蛋白的功能了（是不是又是熟悉的配方，熟悉的味道）。刚才转染的那些载体不就正好能用吗，也不用设计新载体，作者真是机（鸡）智（贼）啊。直接上图吧，其实和一开始做的那些都是一样的。至此证明了一件事，是蛋白而非circF起作用。我想问作者如果把这个标题携程circF-218aa对通过snail抑制CC EMT那这文章能发多少？？后来者可以学习一下，换个说法，鸟枪换炮啊！
这里可以进行一波体内实验验证一下，这个肝转移
老鼠好安详啊
功能和体内实验都做完了，下面开始研究机制。下面作者作了第一种载体和第四种载体的二代测序，找了差异表达靠前的蛋白，然后在细胞系中进行PCR验证，发现了四个真的有差异表达的基因。circFNDC3B-218aa组Snail表达下调，FBP1表达上调。进一步的qRTPCR和western blot结果表明，转染Lv-circFNDC3B或LvcircFNDC3B-218aa后，CC细胞的Snail水平降低，FBP1水平升高。通过文献查询，发现snail可以诱导EMT.这个后面的结果不说估计你也知道了，做EMT。谁来告诉我这个FBP1干什么的，为什么提到这个东西。
然后作者又进一步作了snail与218aa相关的功能实验。
说了半天是不是该说说FBP1了。作者在此大胆假设了circFNDC3B-218aa通过增强FBP1而抑制EMT（我是一脸懵，人在家中坐，雷从天上来啊）。作者将siFBP1和circFNDC3B-218aa高表达质粒转染CC细胞，218aa的作用被siFBP1抵消了。
这个FBP1是何许人也，查文献走一波，FBP1作为一种糖异生调节酶，通过从糖酵解到氧化磷酸化（OXPHOS）的代谢转换，在损害各种癌症的侵袭性表型方面发挥了重要作用。作者研究了circFNDC3B-218aa是否通过FBP1参与Warburg效应抑制而对EMT产生抑制作用。高表达Snail和低表达FBP1的HCT116和DLD1细胞株的葡萄糖摄取、丙酮酸生成和乳酸生成均显著增加，而circFNDC3B-218aa的高表达可逆转这种现象。刚才不是刚说过siFBP1可以抵消218aa的作用吗？这个糖摄取实验为何让我又陷入了沉思，到底FBP1的作用是强还是弱？？
此外，218aa也能提高OXPHOS在snail上调或FBP1沉默时产生的ATP。
这些结果表明，circFNDC3B-218aa通过抑制Snail-FBP1信号轴，增强了从糖酵解到氧化磷酸化的代谢重编程，从而抑制了CC细胞的EMT进程。
全文结束了，看到最后，我沉默了。这个结果是怎么得出来的，全文，都没有验证过snail与FBP1的关系，就得出了snail-FBP1轴，我……再次沉默，小结一下，全文可以说是比较平淡，我觉得除了发现个新蛋白以外没有什么亮点，机制部分做的很水，而且蛋白相互作用都没有验证，作者只做了下游的，感兴趣的小伙伴们可以试着做做上游的，既然都有表型，接着做下去因该也能发个中等水平的文章。谢谢大家！
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