2022年3月9日，Genome Biology在线发表了华中农业大学李青课题组团队题为“DNA demethylation affects imprinted gene expression in maize endosperm”的研究论文。该研究利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）与对应的转录组关联分析揭示了DNA去甲基化酶影响籽粒发育相关基因表达的生物学功能及相关机制，为玉米籽粒产量的遗传改良提供了重要理论支撑。
标题：DNA demethylation affects imprinted gene expression in maize endosperm
期刊：Genome Biology
影响因子：IF 13.583
发表时间：2022.03.09
技术平台：WGBS、RNA-seq、DAP-seq、qRT-PCR、表型和印记分析
背景：
DNA去甲基化发生在许多物种中，并涉及多种生物过程。然而玉米中DNA去甲基化的发生和作用仍然未知。玉米籽粒主要由胚和胚乳组成，基因表达在籽粒发育过程中起着重要的作用。印记现象是玉米胚乳中的一种特异表达模式，即来自双亲的等位基因在胚乳中只有一方表达，只有母本等位基因表达的称为MEG（Maternally Expressed Genes），只有父本等位基因表达的称为PEG（Paternally Expressed Genes）。然而，调控玉米籽粒胚乳印记基因表达的表观遗传学机制尚不清楚。
方法：
作者对玉米中两个调控表观修饰的关键基因（ZmROS1a和ZmROS1b，均属于B73遗传）进行详细的研究。从野生型（WT）、ZmROS1a突变体、ZmROS1b突变体、ZmROS1a和ZmROS1b杂交的双突变体（ZmROS1ab）、WT（或双突变体）和自交系Mo17的F1杂交品系中收集自花授粉14天后的胚和胚乳。样品立即在液氮中冷冻，并储存在-80°C中，随后进行WGBS、RNA-seq、表型和印迹分析等。
结果：
作者分析了编码DNA去甲基化酶的两个关键基因（ZmROS1a和ZmROS1b）功能缺失突变体。结果显示在突变体中未检测到DNA甲基化显著变化，但在基因和一些转座子周围的突变体中检测到DNA甲基化水平增加。DNA甲基化水平的增加伴随着基因表达下调改变，特别是在胚乳中表达的基因中。母本印记基因表达和父本基因印记表达在F1杂交品系中都发生了变化（突变体为雌性亲本、野生型为雄性亲本），但在互惠杂交中没有变化。此外，基因表达改变伴随着等位基因特异性DNA甲基化水平差异，表明DNA甲基化的变异直接调控玉米胚乳印记基因的表达。最后，作者证明双突变体中的高甲基化与转录因子靶标结合位点的减少和基因表达的改变相关。
（1）ZmROS1a突变体、ZmROS1b突变体、双突变体ZmROS1ab的表征
图1 ：WT和突变体的DNA甲基化水平比较
ZmROS1a和ZmROS1b的基因结构
突变体和WT的全基因组DNA 甲基化水平
CG、CHG 和 CHH 位点（上）和 TE（下）周围的 DNA 甲基化水平
（2）ZmROS1ab双突变体的全基因组DNA甲基化模式
图2：ZmROS1ab 双突变体DMR表征
胚和胚乳中WT和ZmROS1ab突变体的DMR。
在WT 中胚胎和胚乳的 DMR。
a的DMR 与b的 DMR 重叠。
c图的DMR重叠DNA 甲基化水平热图。
“ ZmROS1ab敏感” DMR的基因组特征。
（3）ZmROS1ab 调控胚乳基因表达
图3：ZmROS1ab调控胚乳基因表达。
ZmROS1ab敏感基因更有可能在胚乳中表现出差异表达。
大部分ZmROS1ab敏感DEG显示下调（P<0.001）。
ZmROS1ab敏感DEG的组织表达模式。
在胚乳中表达的ZmROS1ab敏感基因更有可能表现出差异表达。
在胚乳中表达的ZmROS1ab敏感DEG更可能表现出下调。
跨组织和ZmROS1ab突变体的ZmROS1ab敏感 DEG的 DNA 甲基化谱。
三种情况下的DNA甲基化水平和在胚乳中特异性基因的表达水平。
WT和ZmROS1ab突变体所有表达基因和胚乳特异性基因的表达水平热图。
WT和Zmros1ab的差异倍数变化分布。
（4）ZmROS1ab与胚乳印迹基因表达
图4：作为母本基因遗传时，ZmROS1ab调控胚乳印记表达
胚乳印记基因的鉴定。
bM和BM F1杂交品系差异表达的MEG和PEG表达水平。
MEG和PEG的组织表达模式。
BM和bM杂交中母本reads比较
（5）印迹基因表达变化与 DNA 甲基化水平变化
图5：胚乳印记基因表达与DNA甲基化有关
a和b. 两个等位基因在野生型BM杂交或MEG（a）和PEG（b）突变型bM杂交中的表达。RT-PCR（右图）和RNA-seq（左图中的条形图）结果。
c和d. 重亚硫酸盐PCR检测a（c）的MEG和b（d）的PEG甲基化水平
（6）ZmROS1ab突变体DNA 甲基化水平与转录因子结合位点
图6：ZmROS1ab诱导的DNA去甲基化影响转录因子（TF）结合。
WT和ZmROS1ab突变体发现ZmO2结合peaks重叠。
鉴定WT和Zmros1ab突变体的差异peaks。
比较差异peaks和非差异peaks的DNA甲基化水平。（P<0.001,ns不显著）
IGV视图显示WT和突变体ZmO2的差异结合。
结论：
以上研究结果证明DNA甲基化的变异直接调控玉米胚乳印记基因的表达，揭示了DNA去甲基化酶影响籽粒发育相关基因表达的生物学功能及相关机制，为玉米籽粒产量的遗传改良提供了重要理论支撑。
关于植物DNA甲基化研究
（1）植物中的DNA甲基化
对于植物而言，面对生长环境的改变，表观遗传的变异会改变植物DNA的构象，从而改变染色质和蛋白质的结构，达到调节基因组的作用。研究发现，当植物面临生物胁迫和非生物胁迫时，植物基因组中DNA甲基化会发生改变，并且这些改变会遗传给后代。所以DNA甲基化的改变能够丰富植物物种的多样性，加强植物的环境适应性。
不同于哺乳动物基因组只有CG甲基化，植物基因组甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的碱基）甲基化。而维持这三种不同的DNA甲基化的分子机制非常复杂。
（2）植物中的DNA甲基化研究技术
（3）植物DNA甲基化研究思路
植物DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
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