三代测序技术（Third Generation Sequencing，TGS）现在主要有美国的 Pacific Biosciences（PacBio）的SMRT和英国的Oxford Nanopore Technology的nanopore技术。
首先对测序来说，最好是对原模板进行直接测序，并且不受读长的限制，但是显然二代测序无法达到这两点，而三代测序弥补了这两点不足。可以对单分子进行测序，nanopore还能避免在扩增的过程中造成的偏好性，对单分子进行测序读长超过了2Mb，还能检测碱基修饰等信息。
1.SMRT技术
这个技术关键的是有一个称为零级波导（zero-mode waveguides， ZMW）的纳米结构。ZMW是一个孔状的光电结构，底部有一个激发光，并且固定着DNA聚合酶。这个激发光在进入ZMW后会呈指数级衰减。当进行合成反应的时候模板和引物与酶结合，互补配对的dNTP因为在底部停留的时间较长，所以能够被激发光激发荧光信号，而其他的游离dNTP则信号弱，这样子就有力区分了背景噪音和荧光信号。在进行一次反应后，由于荧光基团是被固定在dNTP的5’磷酸位上，脱水缩合时能够将荧光基团去除，便于进行下一次的反应。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系，它的损伤主要是由于激光造成的。
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另外通过检测间隔碱基之间的时长可以判断是否存在修饰，因为修饰碱基会影响聚合酶反应的速度，光谱也会发生变化。
这个方法的缺点也很显而易见，因为在进入ZMW之前并没有形成DNA簇，检测的是单分子的荧光信号，因此错误率比较高。但是由于这种错误是随机误差产生的，可以通过多重测序进行纠正。
为了提高测序的准确性，PacBio公司在2019年推出了高精度的HiFi测序。通过CCS（Circular Consensus Sequencing）技术，能够将测序准确度达到99%以上。
这种技术主要运用了滚环复制的优势。这边所用到的DNA聚合酶的活性很强，酶读长远远大于插入片段的读长，因此通过adapter将DNA双链形成环状，使酶围绕着一个模板链进行多次测序，依次来提高测序的准确性。
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3.示SMRT测序过程.jpg
2.纳米孔测序技术
该测序技术的主要原理是：在小孔的两端加上恒定的电压。当单链的DNA/RNA通过纳米孔时，因为不同碱基的形状不同，产生不同大小的电阻，通过检测电压的变化情况，可以判断碱基的类型。
根据测序的方式不同，可以分为两种：外切酶测序和链测序。
外切酶测序：
在膜的两侧放上不同浓度的KCl溶液，DNA单链在核酸外切酶I的作用下，被依次剪切为单核苷酸，检测单核苷酸通过纳米孔时引起的电流变化可以读取DNA的序列。
链测序：
先用解旋酶将双链解旋为单链，马达蛋白控制核酸通过纳米孔的速度。能够解决因为核酸移位速度过快以及电流变化幅度较小造成的差异。
理论上来说，纳米孔测序能够检测DNA和RNA的序列。
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芯片可以重复使用直到纳米孔损耗低于质检标准。能够达到很长的读长，平均在几十到几百kb，是目前测序量最高的平台之一。
二代测序和三代测序的区分
1）首先是在测序的读长方面，二代测序读长普遍在几十到几百kb之间，而三代测序读长甚至能够达到Mb的水平
2）其实是使用的单分子测序还是扩增后测序的差异。三代测序均采用单分子测序，而二代测序均为克隆后测序
3)Ion Torrent，Illumina，PacBio采用便合成便测序，而华大的采用探针技术，nanopore采用了纳米孔测序
4）在检测方法上，Illumina，华大和PacBio采用光信号，Ion Torrent采用了pH,是第一台没有用到光学感应的高通量测序平台。nanopore采用了电信号。
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