关键词

抗体模拟物，生物正交催化，形状选择性，细菌识别，抗菌

文献信息

““Antibody Mimics as Bio-orthogonal Catalysts for Highly Selective Bacterial Recognition and Antimicrobial Therapy”

ACS Nano 2021, 15, 15841−15849

长春应化所/中国科学技术大学--曲晓刚&赵传奇

摘要

摘要图

细菌性传染病正严重威胁着公众健康和生命。抗体和对应多价抗原之间的特异性识别是一种对抗传染病的有效方法。然而，由于抗体成本高、储存和应用条件严格，因此构建稳定性好、结合能力强、切选择性高的人工抗体是非常有意义的，但这也是目前亟需解决的一个重大挑战。鉴于此，作者设计合成了类抗体生物正交催化剂，其可以识别特异性细菌，并通过改进的细菌印迹技术可以在捕获的细菌内实现药物合成。一方面，人工抗体具有能和细菌结合匹配的形形貌，另一方面，它还可以作为生物正交催化剂在活细菌中原位合成抗菌药物。体内和体外实验都证明了设计的抗体可以区分和选择性结合特异的细菌，进而实现药物的激活以清除细菌。因此，这项工作提供了一种设计具有生物正交催化性能的人工抗体的策略，并且可能拓展生物正交化学的应用。

研究背景

细菌感染已经严重威胁公众健康和生命，成为一个棘手的全球健康问题。随着药物滥用，细菌治疗面临的最紧迫的问题是抗生素的耐受性增加。解决细菌感染已采取了多种不同策略，如：水凝胶、量子点、纳米酶、抗菌肽、二维材料、AIE材料、超分子、其他纳米材料、以及一些小分子。其中，选择性抗菌方法被认为是一种通过非特异性灭菌行为解决耐药性和减少边缘效应的潜在有效策略。Zhou等人用不同形貌的Pd纳米晶体实现了对不同菌株的选择性抗菌行为。Grzybowski和他的同事用不同混合电荷的金纳米粒子区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。最近，我们小组用一种光调节策略控制纳米酶表面电荷，以实现可控和选择性抗菌。然而，目前，小分子抗菌剂仍然是最有效的抗菌治疗方法。但是，如何在细菌附近精准的实现原位合成抗菌分子仍具有挑战性。

生物正交催化是一种方便的方法，可以通过在体内产生治疗试剂调控生理过程。很多生物正交反应已被用于操纵调整不同的生理过程和功能。其中，铜催化的叠氮化物-炔环加成反应AuAAC已成为一种最有效的方法。因为其选择性高且高效，它已经在化学和生物领域表现出优异的性能。CuAAC及其相关反应已成功用于生物大分子标记、抗癌前药激活、细菌代谢物标记等。虽然基于聚合物的纳米晶体和一些前药激活方法用于抗菌应用，对抗菌剂的原位合成仍迫切需要有特异性细菌识别能力的生物正交催化剂的设计和合成。

作为天然接受体的模仿策略，分子印迹技术已引起了越来越多关注。一些分子印迹材料已被用于检测、诊断、治疗和其他领域。科学家已经构建了一系列智能材料，可以模仿和记忆原始细菌的形状。他们可以识别细菌，并且依赖光热效应和电化学技术去捕获和杀死细菌。原始细菌的印迹形态使他们有和天然抗体一样的识别能力，因此实现了对木板细菌的优异的捕获能力。因此，通过使用细菌印迹技术，我们设计组装了对特异细菌有识别能力的类抗体的生物正交催化剂，可以模拟抗原抗体反应去选择性识别目标菌株，并在体内合成抗菌剂以灭菌。

结果与讨论

1.抗体生物正交催化剂的设计

使用球形的金黄色葡萄球菌和棒状的大肠杆菌作为模板组装生物正交催化剂。金属离子-单宁酸系统用于螯合和组装在不同形状的材料甚至细胞表面。为了将Cu均匀的覆盖在细菌表面，我们首先在细菌表面包被了金属-多酚膜。在用硼氢化钠还原后，Cu0在细菌表面形成。然后，细菌被原位封装了一层硅壳。最终，子君模板被煅烧以获得一个中空结构，然后通过超声得到一个半壳层的“抗体催化剂”。为了防止铜氧化，最终材料再次用硼氢化钠处理，洗涤后储存在乙醇中。

2.E-Ab和S-Ab的合成过程

E-Ab    大肠杆菌为模板合成的人工抗体

S-Ab    金黄色葡萄球菌为模板合成的人工抗体

首先，按照文献方法收集模板细菌。为了保持细菌形貌，收集的细菌储存在0.9% 的盐溶液中。对于Cu在木板表面的均匀分布，我们先在一定的细菌溶液中引入CuCl2。然后加入单宁酸。接着，加入MOPS缓冲液调节pH至中兴或弱碱性，以促进细菌表面金属-多酚膜的组装。Zeta电位、UV-vis吸收光谱、TEM和元素能谱分析都证实了细菌表面成功包被上了金属-单宁酸膜。为确保Cu的量足够，我们重复包被了3次。

图1.

随后，NaBH4作为还原剂催化Cu2+还原产生零价铜，体系颜色明显变黑。然后，根据文献方法，SiO2壳层引入到Cu表面，形成bacteria@Cu0@SiO2结构。接着，将模板去除得到了一个带有模板细菌形状的中空Cu@SiO2结构。为防止Cu在溶液中受腐蚀，我们改变了文献中的刻蚀方法，在500℃下去除细菌模板。最终，通过超声产生半壳碎片抗体催化剂。值得一提的是，空气中煅烧可能会氧化Cu催化作用，所以超声之后的还原非常重要。Zeta电位、SEM、UV光谱、TEM和元素能谱清晰的证明了最终抗体生物正交催化剂的成功构建。

作为对比，我们组装了没有Cu的壳结构。如图S13-15，我们发现没有Cu时，获得的bacteria@SiO2和半壳非常光滑。这表明E-Ab和S-Ab催化剂包被Cu0的连接处是粗糙的。

3.催化反应模型

作为前提，我们研究了E-Ab和S-Ab是否可以催化CuAAC反应。

图2.

4.体内形状选择性细菌识别和抗菌活性

测试了形状选择性识别能力。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合，用SEM表征。只有E-Ab可以是呗大肠杆菌，表现出形状选择性。为进一步证明选择性识别和捕获能力，我们对混合菌株拍了SEM。加入人工抗体后，S-Ab表现出对金黄色葡萄球菌的靶向倾向，而对大肠杆菌则没有。因为金黄色葡萄球菌的形状较规则，我们通过SEM测量了S-Ab的尺寸。如图S35，很多S-Abs仍有明确的选择性。这些结果表明人工抗体模拟物对目标菌有选择性识别能力。

通过生长抑制实验检测其选择性抗菌能力。

图3.

5.表皮伤口活体实验

图4

6.限制与改进

尽管我们组转了不同形态（棒状和球形）的抗体模拟物，实现了细菌选择性识别和抗菌剂的体内催化生产，但仍不能实现对有相似形貌细菌的辨别。例如，铜绿假单胞菌和大肠杆菌都是棒状形态。另一个问题是细菌有不同的亚型。葡萄球菌又分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌，它们具有不同的致病性。识别细菌和抗生素，并实现选择性杀菌仍是一个巨大的挑战。

研究结论

这项研究提供了一种建立用于精准治疗细菌感染和降低耐药性的生物正交催化剂的方法。