上两篇已经为大家展示同一个份土壤样本（S组）、同一份粪便样本（F组），同时扩增16S V34，16S V4区域，采取同批扩增，建库测序和同一流程分析的分析结果，数据显示两个区域top30物种/功能基本一致，且16S V4可以注释到更多的物种，主要集中在低丰度物种（相对丰度低于1%）。本期我们将继续揭晓肠道内容物样本（G组）分析结果。
第一部分：物种数目统计
肠道内容物样本（G组）使用16S V4注释得到的物种数目为16S V34的3倍以上（图1）。同时，我们在结题项目中随机选取了两个扩增区域约1200个样本（不限样本类型），对其注释到的物种数目进行盒型图展示（图2），结果显示使用16S V4区域扩增注释的物种数目要也是大于16S V34的。
图1肠道内容物样本（G组）物种数目盒型图
图2 16S V34、16S V4区域注释的物种数目盒型图
第二部分：属水平top30物种分布
扩增子研究主要集中在属水平物种，基于物种注释结果，实验选取每个分组在属水平上丰度排名前30物种绘制物种相对丰度柱形累加图，结果显示16S V34、16S V4 区域top30的物种基本一致，且16S V4 区域可以发现更多低丰度物种（图3）。
图3肠道内容物样本（G组）16S V34、16S V4区域属水平物种相对丰度top30柱状图
第三部分：α-多样性指标
Alpha Diversity用于分析样本内的微生物群落多样性，通过单样本的多样性分析可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性。样本在两个区域的多样性指数趋势变化基本一致，16S V4区域的多样性数值整体高于16S V34，与注释物种数目相符（图4）。
图4肠道内容物样本（G组）16S V34、16S V4区域α-多样性指标
第三部分：β-多样性指标
Beta Diversity是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析，NMDS分析利用ASVs的丰度信息和物种进化信息，可以更好地反映生态学数据的非线性结构。根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上。选择16S V34、16S V4区域并未对组间重复产生影响，同组样本仍在聚集成簇（图5）。
图5肠道内容物样本（G组）16S V34、16S V4区域NMDS图
第四部分：差异分析-metastat
为了研究组间具有显著性差异的物种，从属水平物种丰度表出发，利用MetaStat方法对组间的物种丰度数据进行假设检验得到p值，并根据p值筛选具有组间显著性差异的物种，16S V34、16S V4两个区域的差异物种均集中在低丰度物种。
图6肠道内容物样本（G组）16S V34、16S V4区域属水平metastat结果
第五部分：功能预测-PICRUST2
PICRUSt2基于数据库中的ASV tree和ASV的基因信息，推断它们共同祖先的基因功能谱，最后将测序得到的菌群组成“映射”到数据库中，从而进行菌群代谢功能预测。结果显示16S V34、16S V4两个区域功能预测结果基本一致。
图7肠道内容物样本（G组）16S V34、16S V4区域功能注释柱形图（去除others）
结果与讨论
结果
1 使用同一份肠道内容物样本DNA同时扩增16S V34、V4两个区域，结果展示16S V4可以注释到更多的物种，主要集中在低丰度物种（相对丰度低于1%），属水平top30的物种两个区域展示基于一致；
2 多样性指标中，α-多样性指标中，样本在不同区域变化区域保持一致，β-多样性的显示，扩增16S V34、V4区域，不影响组内的重复性；
3 两个区域的metastat差异结果中，超80%的物种没有差异，存在差异物种集中在低丰度物种；
4 功能预测中EC中，功能注释top30的功能也基本保持一致；
讨论
基于测试数据，16S V34、V4结果整体差异不大，且V4要优于V34。由此，更加推荐V4区域，主要原因有：
1 16S V4（515-806）引物通用性相对是所有可变区是最高的，且在大规模菌群调查研究中，如人体菌群研究HMP，地球微生物计划EMP，美国肠道计划AGP以及全球土壤菌群调查，都采用V4区作为检测区域。16S V4目前仍然是国际研究中使用最广泛和认可的检测区域。
2 16S V4（515-806）可以检测到更多低丰度物种，有助于全面揭示微生物群落的多样性；
3包含土壤、粪便、肠道、生物膜等类型的高分文献，也都在使用V4区域。
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