小编今天给大家带来一篇2012年cell杂志发表的 关于m6A在mRNA上富集的综合分析文献解读和文献中研究方法的介绍。

Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and Near Stop Codons

文献摘要：m6A在RNA的转录后修饰中是普遍存在的，而之前发现的肥胖疾病相关的基因FTO基因能编码一种m6A去甲基酶影响m6A，是生理学进程中重要的调控作用。本文介绍的是一种在全转录组范围内分析m6A分布的方法：MeRIP-Seq。作者用这种方法鉴定出来7,676个哺乳动物的包含m6A的mRNA基因，表明了m6A是mRNA共有的分子碱基修饰作用，同时m6A表现出来很强组织特异性调节并且在大脑发育过程中明显增加。作者发现m6A在mRNA的3’-UTR区和终止密码子附近含量丰富，并且m6A的富集区域与3’-UTR的microRNA结合区相关联。这些发现揭示了一种哺乳动物转录组表观调控的观点。

1、哺乳动物mRNA的m6A检测

作者首先通过dot blot的方法验证m6A抗体是否能与RNA上的m6A产生免疫反应，先分别将m6A修饰的寡聚核苷酸和非修饰的寡聚核苷酸点在尼龙膜上，然后用m6A抗体进行免疫反应，再将m6A修饰的寡聚核苷酸点在膜上，用于免疫反应的m6A抗体分别用不同浓度的修饰RNA和非修饰的RNA竞争结合后与膜上的m6A修饰的RNA进行免疫反应，说明该m6A抗体只和m6A修饰的RNA产生免疫反应。

image

图注：A是不同浓度的M6A修饰和未修饰的RNA与m6A抗体的免疫反应，B是用M6A修饰的RNA和未修饰的RNA与膜上的M6A修饰的RNA竞争性结合m6A抗体，表明m6A抗体与m6A修饰的RNA结合而与未修饰的RNA不结合。

随后作者通过检测不同组织中m6A说明神经组织的RNA甲基化比其他组织高，并且在整个大脑发育过程中m6A含量丰富。作者用寡聚核苷酸（dT）进行RNApull-down钓取细胞Mrna后用m6A抗体进行免疫检测说明mRNA的甲基化，然后通过寡聚核苷酸（dT）杂交获取的mRNA用RNaseH（一种降解polyA尾的RNA水解酶）处理后再进行免疫检测说明Mrna的m6a修饰不是在poly(A)尾上。

image image

图注：A是小鼠不同组织RNA的m6A检测，B是小鼠生长不同阶段的大脑组织RNA的m6A检测，C是用寡聚核苷酸Dt序列钓取细胞的mRNA然后检测m6A，D是钓取的Mrna用RnaseH去除Mrna的poly(A)尾后检测m6A。

2、MeRIP-Seq检测转录组中含m6A的RNA

为了检测RNA上的m6A，作者通过MeRIP先将细胞总RNA片段化为大约100bp左右，用m6A抗体钓取细胞含m6A的RNA片段，然后进行高通量测序分析m6A的位置，表明大部分的m6A在mRNA的3’端。随后作者用其中的Ldlr mRNA的反向互补序列作为探针钓取细胞的Ldlr mRNA进行m6A的免疫反应验证。

image

图注：A为MeRIP-Seq的数据分析中mRNA甲基化的信息，B为Ldlr mRNA的RNA-RNApull-down后进行m6A免疫检测验证Ldlr mRNA甲基化。

MeRIP-Seq数据分析表明m6A集中在在motif G[AG]ACU和其变体[AC]GAC[GU],GGAC, [AU][CG]G[AG]AC上，并且在U-rich的motif上几乎不含m6A。

image

3、本文所用的主要研究方法

（1）dot blot：斑点杂交印迹法。

image

先将m6A修饰的RNA固定在尼龙膜上，然后用m6A抗体进行免疫反应，分别用m6A修饰的RNA和未修饰的RNA作为m6A抗体的竞争结合探针，在加入m6A修饰的RNA时，随着加入的RNA量增加，抗体与膜上的RNA反应降低；而加入非修饰的RNA时，抗体与膜上的RNA反应不受影响

（2）MeRIP-Seq：m6A特异性的甲基化RNA免疫沉淀技术

image

MeRIP-Seq实验方法：先将提取的细胞总RNA进行片段化处理，然后与m6A抗体一起孵育，再用磁珠吸附m6A抗体与m6A-RNA的复合体，洗脱的RNA片段进行高通量测序。

（3）RNA-RNA pull-down

image

作者用Ldlr mRNA的互补序列探针进行pull-down实验钓取细胞的Ldlr Mrna，然后用m6A抗体进行WB检测pull-down产物，表明Ldlr Mrna上含有m6A富集。CTL探针的pull-down产物作为对照。

文献原文：Kate D. Meyer,Yogesh Saletore,PaulZumbo,et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in3' UTRs and Near Stop Codons[J].Cell, 2012,149(7): 1635–1646