作者前注：新冠核酸检测技术在2020年10月，基本上在县级实验室推开。实践中，难免产生对新技术困惑。以下文摘可以解开我们的一些困感，但是，认识是在不断改变的，一些厂家技术也在努力前行，因此所有数据认识仅供参考。
核酸的化学组成是磷酸、戊糖、碱基组成。碱基就分为嘌呤、嘧啶两类。戊糖共有5个碳原子，标以C-1’、C-2’、C-3’、C-4’、C-5’.其中以C-5’原子上的羟基可以与磷酸反应，脱水生成酯键，构成核苷酸或脱氧核苷酸。；脱氧核苷酸C-3’原子的羟基能够与另一个脱氧核苷酸C-5’原子的磷酸基团缩合形成3’，5’磷酸二酯键，生成了一个二聚脱氧核苷酸分子。这个二聚脱氧核苷酸分子仍保留着C-5’原子的磷酸基团和C-3’的羟基，这个分子具有5’末端和3’末端之分的方向性。由此酯化反应可以连续进行，产生一个由多个脱氧核苷酸构成的、具有方向性的线性大分子，即DNA分子。
新冠ORF1ab荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
新冠N荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
探针是一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用荧光染料或者酶标记成探针，它们以共价键相连。
某些理化因素（温度、pH、离子强度）会导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断隔裂，使双链DNA解离为单链，这种现象称为DNA变性。DNA变性只改变其二级结构，不改变它的核苷酸序列。实验室内最常用的DNA变性方法之一是加热。DNA变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的瘟度范围内完成的。
当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后可以复性，这一过程称为退火。
【参考文献】查锡良，生物化学（第七版）[M]。北京，人民卫生出版社出版,2008:40—50
复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种生物分子共同参与：
底物即脱氧三磷酸核苷dNTP,聚合酶依赖DNA聚合酶，模板，引物（提供3’－OH末端使dNTP依次聚合）；组成PCR反应体系的基本成分包括模板DNA、特异引物、耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、dNTP以及含有Mg2+缓冲液
引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢健形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物一靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点。
PCR的基本反应步骤：
（1）变性（双链DNA解离为单链）：将反应体系加热到95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。
（2）退火：将温度下降至适宜温度（一般较解链温度Tm低5℃）使引物与模板DNA结合。
（3）延伸：将温度升到72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应（实质是磷酸二酯健的不断生成具有方向的大分子DNA）。
（4）上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25~30次）即可达到扩增片段的目的。
【参考文献】查锡良，生物化学（第七版）[M]。北京，人民卫生出版社出版,2008:481—484
聚合酶链式反应（PCR） 技术
根据PCR原理［5］设计扩增上下游引物，以提取自病人样本RNA 为模板，进行反转录聚合酶链反应（RT-PCR），利用高温变性打开双链、低温退火引物结合、适温目的基因延伸，30 个左右反复循环即可得到指数级的数量增加，如可检测到大量DNA目的片段即可判定为阳性样品.
（a） 染料法；（b） 探针法
新型冠状病毒遗传物质RNA易裂解，样本的采集、存储及处理方式等多方面因素均可影响检测结果，导致“假阴性”比较多，检出率仅30%~50%，不少患者需进行多次检测
染料法的优点是它可以监测任何dsDNA序列的扩增，检测方法较为简单，成本较低，但也正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，如非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合而产生荧光信号，使实验产生假阳性结果，因此其特异性不如探针法。
. 核酸检测技术经历由基础定性PCR技术到多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR、数字PCR等技术改进，涌现出环介导LAMP、依赖解旋酶HDA、重组酶介导RPA、链置换SDA、依赖核酸序列NASBA、滚环式RCA等多种等温扩增技术，解决了PCR 技术的变温仪器依赖性问题，实现技术上突破升级.
【参考文献】张晓元1） 张艳艳1）等。新型冠状病毒SARS-CoV-2检测技术的研究进展。生物化学与生物物理进展，2020，47（4）：275~285
SARSCoV-2的核酸检测主要包括测序和靶标序列识别，由于SARS-CoV-2的ORF1ab基因、N基因、E基因相对保守，因此被广泛用作核酸检测的靶基因
实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR)技术因其灵敏度高、特异性强、成本较低、快速简便等特点，被认为是冠状病毒检测的金标准，也是目前SARS-CoV-2检测最常用的手段。
实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，并利用荧光信号积累而实时检测反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。基于不同区域的检测性能，推荐将N基因的RT-PCR检测用于病毒筛选，将ORF1b的检测用于病毒验证。
【参考文献】王雪宁1,2，朱元首1,2等。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测技术。生命的化学, 2020, 40(8): 1258-1269
核酸检测是目前确诊COVID- 19 最主要的方法，检测窗口期短，用时少，灵敏度高，特异性强，在病毒早期快速诊断和动态观察抗病毒治疗效果中具有优势。
SARS- CoV- 2 是RNA病毒，需先反转录成cDNA，再利用PCR 扩增病毒核酸，通过Taqman 探针进行定量分析，一般能在4～6小时内获得结果。SARS- CoV- 2 核酸检测针对的位点主要是其基因组的3 段保守基因序列，即RdRp 基因（位于ORF1ab）、N基因和E基因。
检测结果判断如下：
（1） RdRp基因、N基因和E基因均阳性，判为SARS- CoV- 2阳性；
（2） RdRp 基因和N基因均阳性，判为SARS- CoV- 2 阳性；
（3）RdRp基因和E基因均阳性，判为SARS- CoV- 2阳性；
（4） RdRp基因阳性，需重复测定，若仍为阳性，判为SARS- CoV- 2阳性；
（5） N基因、E 基因阳性或两者均阳性，需重复测定，若仍为阳性，则可能是其他近源的冠状病毒；
（6） RdRp 基因、N基因和E 基因均阴性，判为SARS- CoV- 2阴性。
【参考文献】张友春1，汪睿。新型冠状病毒实验室检测方法研究进展。预防医学。2020，32（4）：361－365
段秀枝等［19］分析了不同的病毒灭活方式对SAＲS-CoV-2核酸检测 的 影 响，分别比较了不灭活处理和 56 ℃ 水 浴30 min、56 ℃ 干 浴 60 min 及 60 ℃ 干 浴 30 min 对 3 例COVID-19患者咽拭子核酸检测弱阳性结果的影响。研究发现灭活 后 SAＲS-CoV-2 核酸检测阳性率降低，56 ℃ 水 浴30 min的阳性检出率较 56 ℃干浴 60 min 及 60 ℃干浴30 min高，但是差异无统计学意义。
【参考文献】段秀枝，王旭楚，俞攀，等． 病毒灭活处理对 2019 新型冠状病毒
核酸检测弱阳性结果的影响［J/OL］． 中华检验医学杂志，2020，43 ( 2020-03-09) ［2020-03-18］． http: / /rs． yiigle． com/yufabiao /1184369．htm． DOI: 10．3760/cma．j．cn114452-20200227-00138．
选择 2020 年 2 月 22 日至 3 月 5 日在武汉市金银潭医院北七楼病区住院和出院的 33例符合新型冠状病毒肺炎确诊标准的经过治疗处于恢复期的患者为研究对象，一例患者采咽拭子同时采集痰液，间隔相同时间再次同时采集咽拭子和痰液共66份标本。咽拭子新型冠状病毒核酸阳性率仅9.1%，而痰标本核酸阳性率达45.5%，差异有统计学意义（χ2=22，P<0.01）。
【参考文献】徐德翠，陈维，朱木新，聂琦，陈华，周勇，郭义平，程文涛，吴建红．33例新型冠状病毒肺炎患者治疗后的咽拭子和痰标本核酸检测结果比较[J/OL]．武汉大学学报(医学版). https://doi.org/10.14188/j.1671-8852.2020.0196
在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。(2)Ct值：C代表Cycleikl/循环意思，t代表threshold
['θreʃhəʊld]阈，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数[2]
【参考文献】阳成波,印遇龙,龚建华,等.实时定量PCR研究进展及其应用[J].中国预防兽医学报,2003,25(5):359-399.
一般来说，荧光扩增整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
【参考文献】马月萍,戴思兰,马艳蓉.荧光定量PCR技术在植物研究中的应用[J].生物技术通报,2011(7):37-4
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。
若阴性对照出现扩增，可以考虑由于环境污染而造成的假阳性。此时应设立空白对照检测。若出现阳性则说明发生环境污染，此时应对室内进行通风、擦洗工作台及实验用品，并对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，更换所有试剂。阳性对照 Ct 值＞ 40，则需考虑 RNA 降解，此时应对试验用离心管、吸头重新高压灭菌，并严格按操作流程进行实验。
【参考文献】杨舒雯,荧光实时定量 PCR 法检测流感病毒核酸的质控结果[J].临床研究 .2020,28(10):32-34.
PCR 扩增完成后， 尽量避免打开密封反应体系。 禁止把PCR 产物带到配制 PCR 体系的区域内， 同时禁止在配制 PCR反应体系的区域内，操作含核酸或质粒的溶液。
【参考文献】 陈昌海,开妍,邱冬,等.非洲猪瘟病毒荧光 PCR 检测假阳性的原因与预防措施[J]. 中国动物检疫,2020,37(2):49-52
把 PCR 反应的前 6 个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 荧光阈值的默认设置是 2~6 个循环本底荧光信号平均值的12 倍。 样品的荧光强度超过过背景荧光值（荧光阈值）的时刻所对应的循环数，叫做 Ct 值。
【参考文献】潘慧芳，非洲猪瘟病毒荧光定量 PCR 检测中的常见问题[J].疫病防控，
日常检测非洲猪瘟样品时，常常出现阳性对照有典型的“S”型扩增曲线，但不显示 Ct 值（Ct 值显示为 Undetermined）。 有学者指出[4]，出现这种情况的主要原因是仪器默认的荧光阈值线过高。 解决方案：将荧光阈值一般设在 PCR 指数扩增的起始，并高于阴性对照曲线。
【参考文献】[4] 孙华伟， 张敬峰. 荧光定量 PCR 在非洲猪瘟检测中的常见问题与解决方案 [J]. 猪业科学 SWINE INDUSTRY SCI?ENCE,2019,36(12):128-129.
实时荧 光 定 量 PCR 的 扩 增 曲 线可 由 4 个 时 期 进 行 描述，即基线期、指数增长期、线性增长期与平台期。在基线期部分，强背景信号掩盖了微弱的荧光信号，故此时期无法对模板的起始量进行分析。反应进入平台期，反应管内的 dNTP、酶等被耗尽，反应环境已不适合 PCR 反应的进 行，此 时 的PCR 产物不再增加，荧光信号达到水平状态，且同一模板的多次技术重复的扩增曲线在该时期重复性差、可变性高，故在这一时期同样不适合进行模板初始量的分析。在线性增长期，虽然 PCR 反应仍在进行，但产物已不再呈指数形式增加，在该时期也不适合模板初始量的分析。在指数增长期，反应各组分（引物、dNTP、Mg+、酶）均过量，反应所需的环境适中，聚合酶活性仍较高，该时期的扩增效率高，产物数量以指数形式增加，且与初始模板量成线性相关[1]。另外，在指数增长期内，同一模板的多个技术重复具有高度的重复性，在这一时期进行数据分析具有可靠性.
实时荧光定量 PCR 中的 3 个概念，即基线、阈值与 CT值是理解其原理的关键。在线性图谱中，基线体现在与 X 轴平行的部分，对数图谱中，它体现在背景信号杂乱的部分，系统会自动形成基线的起始循环数与终止循环数，也可手动调节。荧光阈值指的是荧光强度值，将它界定为 3~15 个循环的荧光信号标准差的 10 倍，在扩增曲线里，穿过阈值与X 轴形成的平行线即为阈值线，系统可自动形成也可手动设置，手动设定阈值时，在指数增长期内重复性好的范围内上下调节。CT 值是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数，与靶点的初始量成反比。整个扩增过程，基线决定阈值，阈值决定 CT 值，为了保证试验结果的准确性，需保证扩增曲线的基线以及阈值设置的合理性。系统一般将基线起始循环数设为 3，正确的基线终止循环数很重要，若背景信号过强，系统会将背景信号误判为扩增信号，自动生成的基线范围比实际范围小，影响扩增曲线的带型以及最终检测到的 CT 值，这种情况可手动设置基线终止循环数，一般将其设为该样品开始扩增的前一个循环。
水解探针的结构特点是寡核苷酸序列的 5′端为荧光报告基团，3′端 为 荧 光 淬 灭 基 团。PCR 扩 增前，探针游离于靶序列外，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光，但有时会因淬灭不彻底，会检测到微弱的荧光。（升温变性阶段），在 PCR 退火时，探针特异性地结合到靶序列上，在延伸阶段，利用 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性将探针水解，荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光信号被释放，并与PCR 产物的数量成正相关。由于水解探针的作用机理依赖于 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性，所以水解探针又称为 Taqman探针
【参考文献】梁子英， 刘 芳。实时荧光定量 PCR 技术及其应用研究进展[J]。现代农业科技，2020（6）：1—4
备注：1、阳性率是47份可疑样本中，各种试剂检测出的阳性率。
2、样本稀释是6种试剂均能检出双基因的5份样本进行样本稀释。上海之江N基因检出率低，故没有稀释比较试验。
3、。6 种试剂各自推荐了不同的核酸提取方法，这样有可能会出现核酸提取试剂与检测试剂不太匹配的情况，
【参考文献】：李懿，李东晓，王博昊，马红霞，郭万申，黄学勇。6 种新型冠状病毒核酸检测试剂的检测性能对比观察[J]。山东医药，2020，60（25）：14——17
各核酸提取方法情况
A 组（普通一步法）：取等量的原始标本和核酸裂解液混匀作为提取产物
B 组（深缩一步法）：取 200 μL 原始标本 12 000 r/min高速离心 10 min，去掉上清液，再加入 30~50 μL 核酸裂解液混匀作为提取产物
C 组（机器磁珠法）：圣湘 S1006 磁珠提取试剂配套圣湘 Nathch S 全自动核酸提取系统提取产物，中间核酸裂解采用常温平置 30 min
D 组（手工磁珠法）：圣湘 S1002 磁珠提取试剂，利用磁力架手工提取产物，中间核酸裂解采用 60 ℃，500 r/min 匀速振荡 10 min
1、不是所有的核酸试剂均还设计有内源性管家基因内标
2、中山达安核酸检测试剂不适用手工核酸提取方法
1、 手工法对三种试剂均不敏感
2、 湖南圣湘核酸试剂相对其他试剂较敏感
3、 中山达安试剂对OFR1ab基因较N基因敏感。但北京卡尤迪、湖南圣湘则相反。其研究还表明，在临床标本中用 qPCR 检测 N 基因的灵敏度更高。
4、 手工磁珠法（60 ℃恒温振荡裂解 10 min）较其他核酸提取法更易于检测核酸。
5、 不同类型的核酸片段在不同试剂不同提取方法中，提取能力是不一样的。
6、 两种试剂可以互补，条件许可时，用两种试剂进行检测同一样本，可以提高检测阳性率。
7、 手工磁珠法与机器磁珠法比较，笔者认为最大不同是前者可以在 60 ℃边孵育边振荡，可以更充分促进核酸释放，一般保持 10 min 裂解时间即可。而机器磁珠法通常是在室温核酸裂解释放，通常要保持 30 min 以上裂解时间，可能也没有充分裂解释放。
【参考文献】：张运洪，秦维超，游凤霞，何玲，赵文斌，赵宇宏．4 种核酸提取方法对 3 种新型冠状病毒核酸检测试剂检测性能比较与分析．检验医学与临床.
http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1167.r.20200422.1135.0
2. 2 核酸检测假阴性的影响因素［9］
2. 2. 1 病原学
由于 SAＲS － CoV － 2 是单链 ＲNA 病毒，容易在传播过程中发生变异，且人类对新型冠状病毒的研究时间尚短，因此，当病毒 ＲNA 的引物设计区域发生突变时，会直接导致核酸检测结果的假阴性。
2. 2. 2 样本
( 1) 采集时间与类型: 《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》中指出，应采集患者发病 3 d 内的标本［10］进行核酸检测，但 SARS-CoV-2 在人体内的潜伏期为 2 ～7 d，很多患者的病程在就诊时已经迁延了数天至数周，无法确定样本采集时是否为检测的最佳时期，亦不能确认样本内病毒载量是否仍然处在方法学的检测范围内［11］; 此外，不同的样本类型，阳性率不同，例如鼻拭子优于咽拭子［12］，检测下呼吸道标本的准确性更高。 ( 2) 样本的质量: 采集患者的样本应包含病毒，且病毒含量应达到核酸检测的下限，影响样本质量的因素包括采样深度不够，未成功采集到鼻腔深处含有病毒的细胞; 有的患者鼻甲肥大、鼻道狭窄或者伴有鼻过敏症状，难以顺利进入鼻腔采集样本; 采集过程中可能会诱发患者产生分泌物，降低样本质量; 未使用专用的病毒核酸采样拭子与保存液; 样本的保存时间过长或者运输中保存温度过高。
2. 2. 3 人员操作
检测人员在核酸提取过程中需要加入病毒裂解液等试剂，操作步骤较多，任一环节的操作不当，均会影响检测结果的准确性。
2. 2. 4 仪器设备
为了保证检测仪器、设备的准确性及检测结果的精确性，工作人员需定期检定与维护相关设备。例如，冰箱的温度会影响样本 ＲNA 的稳定性，移液器的量程不准确会导
致样本的加样误差。
2. 2. 5 试剂
在检测过程中，如果采用了不恰当的提取试剂将大大影响病毒的检出，因此，核酸扩增试剂应选择至少含 SARS-CoV -2 基因的两个位点 ( 开放读码框 OＲF1ab、N 基因或 E基因) ; 同时，还应关注由某些试剂盒引物设计的位点欠佳带来的不利因素，应对其进一步优化。
2. 3 核酸检测假阳性的影响因素［9］
检测结果的假阳性主要是由核酸污染、非特异性扩增、基线设置不合理等因素造成的。 ( 1) 核酸污染: 检测中，由于在核酸提取前、提取环节、上机扩增期间等过程中均可能造成核酸的污染，因此，核酸检测实验室应独立分区、单向流通，禁止跨区域操作，同时，获取样本所用的仪器设备也要避免交叉污染。 ( 2) 非特异性扩增: 主要原因是试剂盒引物设计不具备特异性，因此会形成引物二聚体或引物自身形成发卡结构，进而产生非特异性荧光，导致假阳性。( 3) 基线设置不合理: 设置基线的作用是扣除扩增起始阶段的背景荧光信号，但如果背景信号过强，软件可能会将背景信号误认为扩增信号，这时会导致假阳性。
【参考文献】刘若锦、李挥等，新型冠状病毒核酸检测与抗体检测影响因素的分析评价[J].医疗设备2020，33（10）：186—188
发病后０～７ｄ采集的痰液、鼻咽拭子、口咽拭子３种 类 型 标 本 中，核 酸 检 测 阳 性 率 仅 为６０％，随着病程发展这３种类型标本的阳性率均有所降低，建议标本采集及检测应该在发病后的０～７ｄ进行；标本类型方面，除了肺泡灌洗液阳性率在８～１４ｄ组达到了１００％，痰液在各个不同检测时间段的阳性率都是最高的，而且鼻咽拭子优于口咽拭子［９］。
３ 假阳性的影响因素
假阳性主 要 来 源 于 核 酸 污 染、非 特 异 性 扩 增、结果判读失误［基线（baseline）设置不当］。
3.1 核酸污染因素 可分为提取前污染（ＰＣＲ 试 剂污染）、提取环节的污染（样本间、对照品的交叉污染、气溶胶污 染）、上 机 扩 增 期 间 的 污 染。解 决 方 案： （１）ＰＣＲ实验室必须是独立的４个区域（试 剂 准 备 区、标本处理区、核酸扩增区、产物分析区），应保持人流、物流的单向流 通，不 得 跨 区 操 作。（２）生 物 安 全 柜 使 用前、后应擦拭 干 净，标 本 处 理 区（非 负 压 条 件 下）应 保持勤通风。操作 时 剧 烈 地 摇 动 试 管，开 盖、吸 样 时 都可形成气溶胶而导致污染，故提取的各个环节操作应轻柔。为避免交叉污染，上机检测前病毒模板加样顺序可调整为 阴 性 对 照 品、标 本、阳 性 对 照 品。部 分 试剂的阳性对照 品 交 叉 污 染 严 重，应 保 持 远 距 离、轻 柔开盖。（３）上 机 扩 增 期 间，高 温 条 件 下 产 生 的 气 溶 胶逸出，因此上机前应盖紧 ＰＣＲ管盖。
3.2非特异性扩增的因素 非特异性扩增的原因主要是引物设计 不 够 特 异，产 生 了 引 物 二 聚 体（引 物 与引物之间互补 结 合 后 扩 增）或 上、下 游 引 物 自 身 形 成发卡结构，产生非特异性荧光导致假阳性。这类假阳性的特点是Ｓ型扩增曲线起线较晚，在最后几个循环内扩增，荧光信号弱，循环阈值（Ｃｔ值）较大。
3.3 结果 判 读 失 误 的 因 素 baseline的 作 用 是 扣 除扩增起始阶段的背景荧光信号，绝大部分扩增仪的软件会自动 设 置baseline的 范 围。但 如 果 背 景 信 号 过强，软 件 可 能 会 将 背 景 信 号 误 认 为 扩 增 信 号，这 时baseline的范围也会很小。这类曲线的特点是曲线起线较早，呈曲折 样 上 升 型 或 不 规 则 上 升 型，而 不 是 光滑的Ｓ型 曲 线，此 时 需 要 手 动 调 整baseline范 围，同时对比原始曲线和扩增曲线形态进行判别。
【参考文献】李振昊、高小玲等，新型冠状病毒核酸检测分析[J].检验医学与临床，2020，17（10）：1313－1315
目前核酸检测多采用qPCR 技术，其检测原理决定了大多数试 剂 盒 的 检 测 灵 敏 度 为100~500拷 贝，这些试剂盒对于高浓度病毒检出问题不大，但是不同厂家甚至于不同批次的试剂盒对于“灰 区”的 判 定 则明显不一致。
大 部 分 假 阴 性 患 者 处于疾病发展 的 早 期。从 现 有 文 献 报 道 来 看，COVID-19潜伏期长达14ｄ，个别病例甚至达到了29ｄ，早期临床表现不典 型，一 旦 进 入 快 速 发 展 期，病 程 进 展 极快［８］。在感染早期，病毒复制数量达不到qPCR 检测阈值的时候，出现假阴性不可避免。
【参考文献】高维寅，张洪，罗阳。新型冠状病毒肺炎核酸检测中的假阴性分析及对策[J].国际检验医学杂志，2020，41（6）：641－643
避免2019－nCoV核酸检测报告出现“假阴性”的应对策略
优化样本采集 （1）加强检测样本采集人员培训和患者宣教，强化患者配合，规范采集操作。（2）多部位采集、多种样本混合检测。每次检测可同时将鼻咽和口咽拭子，以及痰、粪便等不同部位、不同形式的样本，经处理后混合进行一次性检测，提高检测阳性率。（3）明确采集样本优先次序。首选痰标本，其次为鼻咽、口咽拭子，再次粪便标本等。
【参考文献】王达，董梁等，新型冠状病毒核酸检测中的思维误区[J]。中华医院感染学杂志，2020，30（8）：1167－1170
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