三、第三代测序技术
一、单分子荧光测序
1.1测序平台
Pacific Biosciences 公司，简称为PacBio,这是目前为止，读长最长的下一代测序技术公司。 读长最长可达2~3万个碱基，平均可达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上，值得注意的是，在测序过程中，这些序列的读长也不再是相等的。
1.2 Pac Bio 测序过程
测序原理同高通量测序过程一样，边和成，边测序。以SMRT芯片为测序载体。下图为SMRT芯片以及其放大的样子，芯片上整齐排列这15万个直径为70纳米的测序微孔。
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聚合酶固定在测序小孔的玻璃底板上。
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聚合酶和DNA模板、测序引物结合在一起。
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加入带四色荧光的dNTP底物
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在合成时，游离的dNTP被固定在底板上的聚合酶捕获，所激发的光会从玻璃底板底部发出
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在测序时，各个小孔中都有各自的DNA片段，同一时间会发出不同颜色的激光。
1.3 Pac Bio 的哑铃状文库
- 整个文库是一个完整的圆环，这有利于进行周而复始的滚环复制、滚环测序
- 通过对一个片段重复测序，可以提高预测准确度。
1.4 Pac Bio 的优缺点
优点：无需前期扩增，不引入偏向性；读长长 缺点：错误率高
二、牛津纳米测序
牛津纳米孔可以实现很多检测、包括DNA、RNA、miRNA以及蛋白质。
2.1 测序平台
ONT全称Oxford Nanopore Technologies，直译就是牛津纳米孔技术，是三代测序平台中一种。
- Nanopore测序特点一
- Nanopore测序特点二
测序读长非常长，最长的可以达到30万~40万个碱基
2.2 工作原理
Nanopore测序的核心部件是蛋白质纳米孔，称之为Pore
其本质是在膜上形成通道，在牛津纳米孔系统中，纳米孔被插入在可以施加电压的膜上。
施加跨膜电压，离子会通过蛋白质小孔，从膜的一侧移动到膜的另一侧。 当DNA单链通过这个小孔的时候，就会对离子的流动造成阻碍，不同的碱基造成的阻碍大小是不一样的。
2.3 测序原理
- 解螺旋，将DNA双链解开成单链
- DNA单链分子通过蛋白通道，通道中有一个充当转换器的蛋白分子
- DNA单分子停留在孔道中，有些离子通过带来电流变化，而不同的碱基带来的变化是不同的
- 转化器蛋白分子感受5种碱基的电流变化
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根据电流变化的频谱，应用模式算法识别得到碱基序列。
2.4 建库方法
Nanopore的DNA库分为1D库和1D2库
两种文库的区别是1D2库的两端上专门加上了1D2库接头。这个特殊的接头可以让第二链紧跟在第一链后面被测序。
1D
- 1D：即正链反链是完全分离开的，在测序时分别被单独测序 1D建库有两种方法
标准建库
- ①把DNA的两端补齐、末端加上A碱基，接上接头
- ②再加上一个Teher蛋白，它把DNA链吸附在测序芯片的膜上。
转座子酶快速建库
- 把连了接头序列的转座子酶与长链DNA混合后，酶把长链DNA切断
- 在DNA的断点上加上接头，再加上动力蛋白和Tether蛋白进行测序。
1D2
- 在DNA的两侧先接上1D2的接头
- 再接上测序接头，动力蛋白和Tether蛋白
1D2接头可以让负链紧跟着正链被测序，因为两链互补，所以可以把两条序列进行相互校正，以提高对碱基序列判读的准确性。
参考链接：
1、https://www.jianshu.com/p/15dd0baca47c
2、https://www.bilibili.com/video/BV1KJ411k7R2?spm_id_from=333.999.0.0
3、https://www.bilibili.com/video/BV1ZJ411r719?spm_id_from=333.999.0.0
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