三代测序技术总结

第三代基因测序技术又被为“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序技术）
目前的三代测序分为：10XGenomics (Illumination公司的技术)，PacBio-SMRT 和Nanopore sequencing
技术缺陷：

• （基于二代的改进，严格说还是二代）10XGenomics 受GC含量影响比较大。高GC时候，覆盖率会有偏向性。
• PacBio-SMRT 错误率比较高，能达到14%，可以通过多次测序来纠错。不过测序错误，没有偏向性，是随机产生的。
• Nanopore 可以直接测序DNA和RNA,读长比较长，便携，错误率和PacBio差不多。
  目前比较火的单细胞转录组测序分为：Smart-seq 2和10XGenomics

三代测序的应用：

• DNA质量要求

  • 必须为双链DNA（dsDNA）
  • 避免反复冻溶，未经高温处理（>65°C）
  • DNA保存溶液pH在6-9之间，建议保存于弱酸性换环境；
  • OD260/280 在 1.8_{2.0、OD260/230在2.0}2.2之间
  • 澄清无色，无不溶物；
  • 无RNA的污染；
  • DNA未接触过紫外、荧光燃料等可能损伤DNA 的环境和物质
  • 不含螯合剂（如EDTA）、二价金属阳离子（如Mg2+）、变性剂（如胍盐，苯酚）、去污剂（如SDS、Triton-X100、CTAB）
  • DNA电泳条带单一，条带长度≥23kb，无明显降解
  • Qubit 浓度: Nanodrop 浓度≥0.5（最好接近 1）

• RNA质量要求

  • 浓度>300ng/ul
  • 完整性：RIN值≥8.0；28S/18S>1；基线无上抬或轻微上抬；5S峰正常；
  • 纯度：1.7 <OD260/280<2.2；OD260/230>0.5；260吸收峰正常不偏移;
  • 样品状态：送样粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格；
  • 电泳：无基因组污染；
  • 样品运送前保存在-80℃冰箱；

• 测序应用

  • （1）全基因组denovo测序
  • （2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制
  • （3）全长转录本测序
  • （4）宏基因组测序
  • （5）16SrDNA全长测序
  • （6）细胞器基因组测序
  • （7）全基因组重测序&稀有变异鉴定
  • （8）表观遗传学
    参考：https://blog.csdn.net/yangl7/article/details/108517129