2021-09-18 第一代测序技术归纳

1.双脱氧链终止技术
是在1977年由桑格等人提出来的，主要是巧妙运用了双脱氧核糖核苷酸ddNTP。

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正常的NTP 3’位上有一个羟基，用以和下一个核苷酸形成磷酸二酯键，而ddNTP 2’和3’位都失去了羟基，当加入ddNTP时，链反应终止。
所以在测序时，将反应分为4组，均加入dNTP，引物，模板，DNA聚合酶；在4组中依次分别加入4种含有放射性同位素标记的ddNTP，进行链延长反应。在反应过程中，当掺入的是dNTP的时候能够正常进行，但是一旦加入的是ddNTP，链反应终止，最终每组均产生不同长度的DNA片段。用变性丙烯酰胺凝胶按照分子量大小将这些DNA链分开，通过放射自显影，能够直接在图谱上读出DNA的序列。

2.化学降解法
同年，Gilbert等人提出了化学降解法，首先也是对DNA的末端进行放射性同位素标记，用特异的化学试剂去降解DNA链，产生几组长度不同的DNA链。同样，通过聚丙烯酰胺凝胶分离后放射自显影，直接读取待测DNA的序列长度。

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了解了原理之后，可以发现，sanger的测序是在DNA合成的过程种进行测序的，而化学降解法是对已合成的DNA进行测序，可以检测DNA的修饰情况，试剂比较简单，对实验条件要求不高，所以化学降解法一度被广泛使用。Sanger测序虽然需要引物，DNA聚合酶等，但是现在的高通量测序大都是基于Sanger测序的原理进行的，例如罗氏454，ABI的SOLID等技术。