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研究背景：
肿瘤微环境(TME)在癌症进展和治疗调节过程中是一个高度动态和复杂的网络。单细胞RNA测序(scRNA-seq)等新技术将肿瘤内皮细胞(TEC)描述为TME中的新细胞类型。与正常内皮细胞(NEC)相比，TEC具有改变的形态和遗传表型，包括结构染色体改变和突变。肿瘤和间质细胞之间的相互作用促进前列腺癌(PCa)的进展和扩散。对细胞间通信网络的研究为促进前列腺癌微环境(TME)改变的过程提供了新的治疗途径。
摘要图：
研究结果：
一、人前列腺组织TEC和NEC的分离、培养和鉴定
1、NEC和TEC从67例确诊为前列腺癌的新鲜根治性前列腺切除术标本分离得到，并对NEC和TEC进行全面分析，包括功能特征和RNA-seq（图1A）。
2、通过对典型内皮细胞特征的免疫细胞学检测，证实了分离的PCa来源的TEC和NEC的内皮表型（图1B）。
3、与NEC相比，前列腺TEC显示细胞增殖和迁移增加（图1C，D），与之前关于其他癌症类型的报告一致。
4、前列腺TEC发生形态学变化，如细胞整体大小 (图1E)和细胞核面积较NEC增加(图1F)，但两种细胞的核质比相似(图1G)。此外，在TEC中观察到更丰富的不连续细胞连接(图1H)。
二、RNA-Seq揭示了前列腺TEC和NEC之间的差异
对5个配对的TEC和NEC样本和9个未配对的样本进行了RNA-seq，以确定前列腺TEC和NEC之间的分子差异。
1、通过差异基因表达分析，确定了驱动TEC和NEC之间差异的基因，并确定了将TEC与NEC区分开来的40个基因特征。热图和聚类分析显示了前20个上调和下调基因（图2A）。
2、基因集富集分析预测前10个差异表达通路（图2B），值得关注的是，与体内TEC相关的过程，如细胞外基质生物合成和碳水化合物运输，也排在富集程度最高的过程中。
3、免疫组化探针PLAC9、VDR和PTGIR的病理显微镜下显示， PLAC9、VDR和PTGIR在肿瘤血管系统中的高表达（图2C-E）。此外，体外IF验证培养的TEC和NEC证实VDR的表达量和EC特异性明显增加（图2F）。
三、CXCL12是前列腺TEC标志物
1、NEC和TEC之间的差异分析显示，CXCL12是上调量最多的基因之一，且在IF实验中观察EC的CXCL12表达量，也得到了同样的结果（图3A和B）。
2、Kaplan-Meier曲线显示，在422例PCa患者中，CXCL12高表达与肿瘤生化复发率显著增高相关（图3C）。
3、提琴图显示，CXCL12在大多数其他肿瘤实体中呈下调状态，但在前列腺TEC中高度上调状态（图3D）。
四、前列腺TME单细胞定位识别产生CXCL12的细胞类型
1、为了研究TEC标志物和CXCL12在全TME中的表达，对4名PCa患者的组织进行了scRNA-seq分析（图4A）.
2、t-SNE分析了16529个PCa TME细胞（图4B），结果显示存在B细胞，T细胞，NK细胞，巨噬细胞和单核细胞，肥大细胞，上皮(和癌症)细胞，纤维母细胞和EC，并对应细胞类型的特定基因的表达量进行分析（图4C）。
3、通过对单个细胞群的亚聚类和典型标记基因的注释，共发现27个亚群具有高度差异的基因表达特征（图4D-E）。
4、热图中显示，几个亚群在患者和肿瘤前列腺组织与良性前列腺组织中存在差异（图4F）。
5、热图中显示，两个上皮细胞簇高度表达癌细胞标志物KLK3呈高表达（图5A），其中KLK3也称为PSA，是用于前列腺癌诊断和复发的最常用的标志物。
6、根据基因特征，将成纤维细胞细分为驻留成纤维细胞和基质细胞(周细胞和血管平滑肌细胞)。热图分析显示了纤维母细胞和基质细胞标记物以及其他高度上调基因的表达（图5B）。
7、火山图显示，具有M1和M2特征的巨噬细胞的差异分析（图5C），与M1巨噬细胞相比，促血管生成的M2巨噬细胞CXCL12 mRNA高表达。
五、肿瘤内皮细胞亚型的特征
1、热图分析显示，位列前10的动脉、静脉丛、未成熟血管和尖端细胞的肿瘤EC表达特征的基因（图6A）并用免疫组化IHC实验进行验证其基因表达情况（图6B）。
2、每种内皮亚型中CXCL12和CXCR4的表达量显示， TEC标记物CXCL12在动脉EC中表达最高（图6C）。
3、NEC与TEC的差异分析火山图显示，与动脉NEC相比，CXCL12是动脉TEC中上调量最高的基因之一（图6D）。
4、免疫组化IHC实验对CXCL12蛋白水平的验证与单细胞测序分析一致，并显示其在原发性PCa的TEC中高度特异性表达（图6E）。
5、Kaplan-Meier曲线和风险比率分析显示，高表达动脉EC标记(定义为前10个特异性动脉EC标记基因)的患者在RP后无复发生存期降低（图6F），叶尖细胞、静脉细胞和未成熟细胞的EC亚群基因特征与存活率降低相关（图6G-I）。
六、相互作用分析表明，CXCR4/CXCL12轴是一个候选的抗血管生成靶点
1、通过评估了动脉EC中CXCL12的表达与所有基质细胞的比较（图7A），与所有其他细胞类型相比，CXCL12在血管生成相关的细胞(亚)类型(内皮细胞、f纤维母细胞和M2巨噬细胞)中表达明显更高。
2、Circos图显示使用CellPhoneDB算法的受体-配体相互作用分析显示，在免疫细胞中，CXCL12向其同源受体CXCR4发出旁分泌信号（图7B）。
3、与其他EC表型相比，尖端细胞高度过表达CXCR4，其特征是诱导与血管发育、血管生成、EC发育和肿瘤血管生成相关的促血管生成途径（图7C）。
七、CXCR4/CXCL12抑制前列腺癌的功能验证
1、RT-PCR分析证明，与NEC相比，TEC中CXCL12及其同源受体CXCR4的表达上调（图8A）。
2、细胞增殖实验和划痕实验显示，CXCR4拮抗剂AMD3100可以有效降低TEC的增殖能力（图8B-C）。
3、免疫组化IHC显微镜下结果显示，在CXCR4抑制剂AMD3100处理对比未处理的组织中探测内皮标志物CD31 减少（图8D）血管密度也减少（图8E）。
总结：在此研究中，作者对前列腺癌肿瘤内皮细胞(TEC)进行了详细的描述，描述TEC和前列腺癌TME之间的细胞间相互作用，确定了新的前列腺癌TEC靶点，并强调CXCR4/CXCL12相互作用是一个潜在的新靶点，可以干扰前列腺癌中的肿瘤血管生成。
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