近些年，转录组测序凭借其周期短，价格低，普适性高等优势，备受科研人员的青睐。在普遍的认知里，普通转录组想要发表更好的文章，往往要进行几十上百个样本的分析，或结合多组学联合分析，又或者进行大量分子生物学实验····但本次转录组测序项目文章告诉你：这些都不是必须的！！！即便是在转录组测序已经变成常规手段的今天，凭借转录组测序标准分析和常规的验证实验依然可以发表IF＞5的文章。
2022年3月29日，河南科技学院胡老师在Frontiers in Pharmacology（IF=5.81）发表题目Molecular Mechanisms Underlying the Inhibition of Proliferation and Differentiation by Florfenicol in P19 Stem Cells: Transcriptome Analysis [1]的研究论文，仅通过6个样本的转录组测序+标准分析+验证实验，成功阐述了氟苯尼考抑制P19干细胞增殖和分化的分子机制。本研究中诺禾致源提供转录组测序分析专业服务。
研究背景
氟苯尼考（FLO）是氯霉素和甲砜霉素的衍生物，广泛用于兽医诊所和水产养殖中，以对抗细菌感染并促进动物生长。在作者之前的研究中，发现FLO抑制了鸡胚胎发育并诱导了早期胚胎死亡，尽管FLO诱导的胚胎毒性背后的机制尚未完全清楚。在本研究中，作者选择P19SC作为模型系统来研究FLO的毒性作用和转录水平的潜在机制。在P19SC中研究了FLO对增殖、多能性和整体转录以及心脏分化的影响。作者还鉴定了DEGs，进行了生物信息学分析以获得关键基因，并进行了一些功能分析。
实验方法与测序策略
实验材料：小鼠P19SC和FLO处理的小鼠P19SC
测序方法：RNA-seq
测序平台：Illumina NovaSeq 6000；PE150
实验方法：RNA-seq；qRT-PCR；CCK-8；蛋白质印迹检测等
研究结果
1. 氟苯尼考抑制P19SCs的增殖和多能性
作者用FLO处理P19SC 24和48小时，检测细胞活力的百分比及FLO对细胞死亡标志物的乳酸脱氢酶（LDH）释放的影响，以确定FLO对干细胞增殖和存活的影响。实验结果如图所示，FLO以剂量和时间依赖性方式抑制细胞增殖，在25μg/ ml（p >0.05）的剂量下，FLO没有显着诱导LDH释放和细胞死亡。研究结果表明，FLO可以抑制P19SC的自我更新，而不会引起明显的细胞死亡。免疫印迹分析结果分析表明，FLO显着抑制了Sox2和Oct4的蛋白表达，这表明FLO处理的P19SC的多能性被抑制。
图1 氟苯尼考抑制P19SCs的增殖和多能性
2. RNA-seq 差异基因的GO富集分析
本研究采用clusterProfile软件对2396个DEG进行GO功能富集分析。这些基因在血管生成，胚胎器官发育和器官形态发生等生物过程中显着富集。
图2 差异基因GO富集分析
3. RNA-seq 差异基因的KEGG富集分析
本研究采用clusterProfile软件对2396个DEG进行KEGG通路富集分析，共获得45个显著富集的KEGG通路。其中Wnt信号通路共富集了33个DEGs，包括15个上调基因和18个下调基因。
作者还对Wnt通路中的三个关键基因（Wnt3，Wnt8a和Myc）和其他三个基因通过qRT-PCR方法验证RNA-Seq结果。qRT-PCR结果表明，6个基因的表达模式与RNA-Seq结果一致，表明RNA-Seq结果可靠。
图3 差异基因KEGG通路富集分析与Wnt通路基因PPI网络分析
图4 qRT-PCR验证
4. Wnt途径参与介导FLO诱导的毒性作用
作者还分析了β-连环蛋白的表达谱，结果表明，FLO以剂量依赖性方式降低了β-连环蛋白的表达，FLO显着抑制了来自P19SC的EB的形成。使用CT99021激活规范Wnt通路显着提高了β-连环蛋白的蛋白质水平，促进了Myc和Ccnd1的mRNA表达水平，并部分逆转了FLO对P19SCs增殖的抑制作用。
图5 Wnt通路参与介导FLO诱导的毒性作用
5. 蛋白互作网络分析（PPI）
作者对上调和下调的差异基因分别构建了PPI网络，并使用Cytoscape的MCODE应用程序获得了上调DEGs和下调DEGs的最重要模块。使用参与这些模块的基因分析了GO和KEGG途径，发现其主要与泛素介导的蛋白水解，DNA复制机制和细胞周期机制等有关。
图6 DEGs的关键模块和中心基因分析
表1 上调DEG的重要模块的GO和KEGG通路富集分析
表2 下调DEG的重要模块的GO和KEGG通路富集分析
6. Hub基因的选择及KEGG富集分析
上调或下调DEG的中枢基因是通过Cytoscape的cytoHubba应用程序鉴定的，通过DAVID重新分析了这些中枢基因的KEGG途径。结果表明，DNA复制和细胞周期的异常调节可能在FLO诱导的P19SC毒性中起重要作用。
表3 Hub基因的KEGG富集分析
研究结论
本研究发现FLO抑制了P19SC的多能性，增殖和DMSO诱导的分化。使用各种生物信息学分析，确定了显着丰富的BP项，包括FLO治疗后的血管生成和胚胎器官发育，这与之前作者在雏鸡胚胎模型中的发现一致。此外，富集的KEGG通路，特别是规范的Wnt通路，将有助于阐明FLO诱导的P19SC增殖和分化毒性的潜在机制。本研究还分析了模块和Hub基因，发现泛素介导的蛋白水解，DNA复制机制和细胞周期机制参与调节FLO处理的P19SC的多能性和增殖。
研究思路
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