这里是佳奥，我们继续补充相关的背景知识。

1 细胞周期推断

也是通过一些基因的表达来进行分类的。

rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
load(file = '../input.Rdata')
a[1:4,1:4]
head(df) 

##载入第0步准备好的表达矩阵，及细胞的一些属性（hclust分群，plate批次，检测到的基因数量）
##注意 变量a是原始的counts矩阵，变量 dat是logCPM后的表达量矩阵。

group_list=df$g
plate=df$plate
table(plate)
 
a[1:4,1:4]
library(scran)
# https://mp.weixin.qq.com/s/nFSa5hXuKHrGu_othopbWQ
sce <- SingleCellExperiment(list(counts=dat)) 
#list() 创建列表

##这个是小鼠的
library(org.Mm.eg.db)
mm.pairs <- readRDS(system.file("exdata", "mouse_cycle_markers.rds", 
                                package="scran"))

ensembl <- mapIds(org.Mm.eg.db, keys=rownames(sce), 
                  keytype="SYMBOL", column="ENSEMBL")

#取探针名创建一个向量
#rownames(sce) 取行名（即实验检测到的基因）

if(F){
  assigned <- cyclone(sce, pairs=mm.pairs, gene.names=ensembl)
  save(assigned,file = 'cell_cycle_assigned.Rdata')
}
load(file = 'cell_cycle_assigned.Rdata')
head(assigned$scores)
table(assigned$phases)
draw=cbind(assigned$score,assigned$phases) #合并assigned$score列和assigned$phases列
colnames(draw)
attach(draw)
library(scatterplot3d)
scatterplot3d(G1, S, G2M, angle=20,
              color = rainbow(3)[as.numeric(as.factor(assigned$phases))],
              grid=TRUE, box=FALSE)
detach(draw)

library(pheatmap)
cg=names(tail(sort(apply(dat,1,sd)),100))
n=t(scale(t(dat[cg,])))
# pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F)

library(pheatmap)
df$cellcycle=assigned$phases
ac=df
rownames(ac)=colnames(n)
pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F,
         annotation_col=ac,
         filename = 'all_cells_top_100_sd_all_infor.png')
dev.off()
head(ac)
table(ac[,c(1,5)])

> table(ac[,c(1,5)])
   cellcycle
g    G1 G2M   S
  1 298  10   4
  2 272  22   6
  3 121   0   0
  4  32   2   1

QQ截图20220901102109.png QQ截图20220901102213.png

2 rpkm概念与三种计算方法

这一部分讲解rpkm值如何在算法上与counts值统一。

即如何从5 Mb大小的counts矩阵得到23 Mb大小的rpkm矩阵：

rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
load(file = '../input.Rdata')
a[1:4,1:4]
head(df)
##载入第0步准备好的表达矩阵，及细胞的一些属性（hclust分群，plate批次，检测到的基因数量）
##注意 变量a是原始的counts矩阵，变量 dat是log2CPM后的表达量矩阵。

library("TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene")
txdb <- TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene
?TxDb

##part1 下面是定义基因长度为 非冗余exon长度之和
if(F){
  exon_txdb=exons(txdb)
  genes_txdb=genes(txdb)
  genes_txdb
  ?GRanges
  o = findOverlaps(exon_txdb,genes_txdb)
  o
  ## exon - 1 : chr1 4807893-4807982
  ## 1        6523
  #  genes_txdb[6523]  # chr1 4807893-4846735 , 18777
  t1=exon_txdb[queryHits(o)]
  t2=genes_txdb[subjectHits(o)]
  t1=as.data.frame(t1)
  t1$geneid=mcols(t2)[,1]
  # 如果觉得速度不够，就参考R语言实现并行计算
  # http://www.bio-info-trainee.com/956.html
  # lapply : 遍历列表向量内的每个元素，并且使用指定函数来对其元素进行处理。返回列表向量。
  # 函数split()可以按照分组因子，把向量，矩阵和数据框进行适当的分组;
  # 它的返回值是一个列表，代表分组变量每个水平的观测。
  g_l = lapply(split(t1,t1$geneid),function(x){
    # x=split(t1,t1$geneid)[[1]]
    head(x)
    tmp=apply(x,1,function(y){
      y[2]:y[3]
    })
    length(unique(unlist(tmp)))
    # sum(x[,4])
  })
  head(g_l)
  g_l=data.frame(gene_id=names(g_l),length=as.numeric(g_l))
  
  save(g_l,file = 'step7-g_l.Rdata')
}
load(file = 'step7-g_l.Rdata')

##part2 下面是定义基因长度为 最长转录本长度
if(F){
  
  t_l=transcriptLengths(txdb)
  head(t_l)
  t_l=na.omit(t_l)
  head(t_l)
  t_l=t_l[order(t_l$gene_id,t_l$tx_len,decreasing = T),]
  head(t_l)
  str(t_l)
  t_l=t_l[!duplicated(t_l$gene_id),]
  head(t_l)
  g_l=t_l[,c(3,5)]
  
}

head(g_l)
library(org.Mm.eg.db)
s2g=toTable(org.Mm.egSYMBOL)
head(s2g)
g_l=merge(g_l,s2g,by='gene_id') #把g_l,s2g两个数据框以'gene_id'为连接进行拼接

#merge函数可以实现对两个数据表进行匹配和拼接的功能。

# 参考counts2rpkm，定义基因长度为非冗余CDS之和
# http://www.bio-info-trainee.com/3298.html  
a[1:4,1:4]
ng=intersect(rownames(a),g_l$symbol) #取a数据框的行名与g_l数据框的symbol列的交集
#intersect()取交集

# 有了counts矩阵和对应的基因长度信息，就很容易进行各种计算了：
exprSet=a[ng,]
lengths=g_l[match(ng,g_l$symbol),2]
head(lengths)
head(rownames(exprSet))
# http://www.biotrainee.com/thread-1791-1-1.html
exprSet[1:4,1:4]
total_count<- colSums(exprSet)
head(total_count)
head(lengths)
total_count[4]
lengths[1]
1*10^9/(1122*121297)
rpkm <- t(do.call( rbind,
                   lapply(1:length(total_count),
                          function(i){
  10^9*exprSet[,i]/lengths/total_count[i]
}) ))

rpkm[1:4,1:4]
# 下面可以比较一下 自己根据counts值算出来的RPKM和作者提供的RPKM区别。
a=read.table('../GSE111229_Mammary_Tumor_fibroblasts_768samples_rpkmNormalized.txt.gz',header = T ,sep = '\t')
# 每次都要检测数据
a[1:4,1:4]
rpkm_paper=a[ng,] 
rpkm_paper[1:4,1:4]

rpkm[1:4,1:4]

有关背景讲解就到这里。

下一篇我们进入单细胞转录组数据初探部分。

我们下一篇再见！