单细胞转录组数据校正批次效应实战（下）

刘小泽写于19.6.30、7.7 今天结束这个实战
单细胞转录组数据校正批次效应实战（上）：https://www.jianshu.com/p/7b3d3a707470
单细胞转录组数据校正批次效应实战（中）
https://www.jianshu.com/p/c23fd272eb06
这次结合之前的3个数据集筛选出来的HVGs，看看放在一起怎么处理批次效应

三组不同数据的混合

我们可以从每个数据集（也就是每个批次）中挑选前1000个生物学差异最大的基因

还记得之前是如何得到每个数据集的HVGs吗？主要利用trendVar、decomposeVar，另外存在多个样本使用combineVar进行合并

整合ID

整合三个数据集的前1000基因后，我们用Reduce()对它们取基因名的交集，最后给基因交集寻找搭配的gene symbol

rm(list = ls())  
options(stringsAsFactors = F)
load("gse81076.Rdata")
load("gse85241.Rdata")
load("e5601.Rdata")
# 选择前1000基因
top.e5601 <- rownames(dec.e5601)[seq_len(1000)]
top.gse85241 <- rownames(dec.gse85241)[seq_len(1000)]
top.gse81076 <- rownames(dec.gse81076)[seq_len(1000)]
# https://www.r-bloggers.com/intersect-for-multiple-vectors-in-r/
chosen <- Reduce(intersect, list(top.e5601, top.gse85241, top.gse81076))

# 添加gene symbol
symb <- mapIds(org.Hs.eg.db, keys=chosen, keytype="ENSEMBL", column="SYMBOL")
> DataFrame(ID=chosen, Symbol=symb)
DataFrame with 353 rows and 2 columns
                 ID      Symbol
        <character> <character>
1   ENSG00000115263         GCG
2   ENSG00000118271         TTR
3   ENSG00000089199        CHGB
4   ENSG00000169903      TM4SF4
5   ENSG00000166922        SCG5
...             ...         ...
349 ENSG00000087086         FTL
350 ENSG00000149485       FADS1
351 ENSG00000162545     CAMK2N1
352 ENSG00000170348      TMED10
353 ENSG00000251562      MALAT1

另外，还有一种取交集的方法：先将全部的进行Reduce()，再组合选择前1000

in.all <- Reduce(intersect, list(rownames(dec.e5601), 
    rownames(dec.gse85241), rownames(dec.gse81076)))

# 设置权重weighted=FALSE ，认为每个batch的贡献一致
combined <- combineVar(dec.e5601[in.all,], dec.gse85241[in.all,],
    dec.gse81076[in.all,], weighted=FALSE)
chosen2 <- rownames(combined)[head(order(combined$bio, decreasing=TRUE), 1000)]

取交集的方法会了，但是有个问题不知你有没有注意到：

取交集前提是三个批次之间有相同的HVGs，但是如果对于不同细胞类型的marker基因，它们特异性较强，不一定会出现在所有的batch中

只不过，我们这里只关注交集，因为每个数据集(batch)中的不同donor之间除了marker外，还存在许多表达量又低生物学意义又小的基因，而这些基因用mmCorrect()也不能校正，会给后面的左图带来阻碍，因此这里选择忽略它们

进行基于MNN的校正

简单理解MNN（Mutual nearest neighbors ）做了什么

想象一个情况：一个batch(A）中有一个细胞(a)，然后再batch(B)中根据所选的feature表达信息找和a最相近的邻居；同样地，对batch B中的一个细胞b，也在batch A中找和它最近的邻居。像a、b细胞这种相互距离（指的是欧氏距离）最近，来自不同batch的作为一对MNN细胞

Haghverdi et al. (2018)：MNN pairs represent cells from the same biological state prior to the application of a batch effect

利用MNN pair中细胞间的距离可以用来估计批次效应大小，然后差值可以作为校正批次效应的值

下面就利用mnnCorrect()函数对三个数据集（batch）进行校正批次效应，使用的基因就是chosen 得到的。下面先将三个数据集的表达量信息用logcounts提取出来，并且这个函数做了log的转换，降低了数据的维度；然后将它们放在一个列表中，并根据chosen的基因选择出来前1000个HVGs的表达量信息，是为了后面的循环使用；接着利用do.call() 对每个表达矩阵进行mnnCorrect()操作

original <- list(logcounts(sce.e5601)[chosen,],
                 logcounts(sce.gse81076)[chosen,],
                 logcounts(sce.gse85241)[chosen,])
corrected <- do.call(mnnCorrect, c(original, list(k=20, sigma=0.1)))
> str(corrected$corrected)
List of 3
 $ : num [1:353, 1:2285] 0.127 0.137 0.121 0 0.113 ...
  ..- attr(*, "dimnames")=List of 2
  .. ..$ : chr [1:353] "ENSG00000115263" "ENSG00000118271" "ENSG00000089199" "ENSG00000169903" ...
  .. ..$ : chr [1:2285] "HP1502401_J13" "HP1502401_H13" "HP1502401_J14" "HP1502401_B14" ...
 $ : num [1:353, 1:1292] -0.01724 -0.0062 0.01149 0.00689 0.01272 ...
 $ : num [1:353, 1:2346] 0.142 0.138 0.132 0.109 0.11 ...

关于参数的解释：

• k 表示在定义MNN pair时，设置几个最近的邻居(nearest neighbours )，表示每个batch中每种细胞类型或状态出现的最低频率。增大这个数字，会通过增加MNN pair数量来增加矫正的精度，但是需要允许在不同细胞类型之间形成MNN pair，这一操作又会降低准确性，所以需要权衡这个数字

  增大k值，会提高precision，降低accuracy

• sigma 表示在计算批次效应时如何定义MNN pair之间共享的信息量。较大的值会共享更多信息，就像对同一批次的所有细胞都进行校正；较小的值允许跨细胞类型进行校正，可能会更准确，但会降低精度。默认值为1，比较保守的一个设定，校正不会太多，但多数情况选择小一点的值会更合适

  减小sigma，会增加accuracy，降低precision

  这里很有必要说明两个英语词汇：

  • Accuracy refers to the closeness of a measured value to a standard or known value. 和标准值比是否"准确"
  • Precision refers to the closeness of two or more measurements to each other. 相互之间比是否"精确"

• 另外，提供的original list中各个batch的顺序是很重要的，因为是将第一个batch作为校正的参考坐标系统。一般推荐设置批次效应最大或异质性最强的批次作为对照，可以保证参考批次与其他校正批次之间有充足的MNN pair

检验校正的作用

创建一个新的SingleCellExperiment对象，将三个原始的矩阵和三个校正后的矩阵放在一起

# omat是原始矩阵，mat是校正后的
omat <- do.call(cbind, original)
mat <- do.call(cbind, corrected$corrected)
# 将mat列名去掉
colnames(mat) <- NULL
sce <- SingleCellExperiment(list(original=omat, corrected=mat))
# 用lapply对三个列表进行循环操作，求列数，为了给rep设置一个重复值
colData(sce)$Batch <- rep(c("e5601", "gse81076", "gse85241"),
                          lapply(corrected$corrected, ncol))

> sce
class: SingleCellExperiment 
dim: 353 5923 
metadata(0):
assays(2): original corrected
rownames(353): ENSG00000115263 ENSG00000118271 ... ENSG00000170348
  ENSG00000251562
rowData names(0):
colnames(5923): HP1502401_J13 HP1502401_H13 ... D30.8_93 D30.8_94
colData names(1): Batch
reducedDimNames(0):
spikeNames(0):

做个t-sne图来看看

图中会显示未校正的细胞是如何根据不同批次分离的，而校正批次后细胞是混在一起的。我们希望这里能够混在一起，是为了后面的分离是真的由于生物差异

osce <- runTSNE(sce, exprs_values="original", set.seed=100)
ot <- plotTSNE(osce, colour_by="Batch") + ggtitle("Original")
csce <- runTSNE(sce, exprs_values="corrected", set.seed=100)
ct <- plotTSNE(csce, colour_by="Batch") + ggtitle("Corrected")
multiplot(ot, ct, cols=2)

看到E-MTAB-5601这个数据集分离的最严重，推测可能其他数据集采用了UMI

然后再根据几个已知的胰腺细胞的marker基因检测一下，看看这个校正是不是能反映生物学意义。因为如果校正后虽然去除了批次效应，但如果每个群中都体现某个细胞marker基因，对后面分群也是没有意义的。

ct.gcg <- plotTSNE(csce, by_exprs_values="corrected", 
    colour_by="ENSG00000115263") + ggtitle("Alpha cells (GCG)")
ct.ins <- plotTSNE(csce, by_exprs_values="corrected", 
    colour_by="ENSG00000254647") + ggtitle("Beta cells (INS)")
ct.sst <- plotTSNE(csce, by_exprs_values="corrected", 
    colour_by="ENSG00000157005") + ggtitle("Delta cells (SST)")
ct.ppy <- plotTSNE(csce, by_exprs_values="corrected", 
    colour_by="ENSG00000108849") + ggtitle("PP cells (PPY)")
multiplot(ct.gcg, ct.ins, ct.sst, ct.ppy, cols=2)

结果可以看到校正后依然可以区分细胞类型，说明既达到了减小批次效应的影响，又能不干扰后续细胞亚型的生物学鉴定

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