逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo（dT） 或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的 基因或检测基因表达。RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA 探针、构建 RNA 高效转录系统。

详细
实验方法 : 逆转录-聚合酶链反应实验方法
实验材料

• 组织或细胞样品

试剂、试剂盒

• RNA 提取试剂
• dNTP 混合物
• Taq DNA 聚合酶
• 第一链 cDNA 合成试剂盒

仪器、耗材

• 离心管

• 离心机

• 水浴锅

• PCR 管

• 电泳仪

• 凝胶图像分析系统

一、反转录酶的选择

1. Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶H活性相对较弱。最适作用温度为 37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶H活性。最适作用温度为 42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn²⁺存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA模板的二级结构。
4. MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长 cDNA。

二、合成 cDNA引物的选择

1. 随机六聚体引物：当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长
   序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体
   系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的
   特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。

2. Oligo(dT)：是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA 具有 3’端
   Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的
   1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方
   面均要小。

3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，
   若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起
   始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。

三、 试剂准备

• RMA 提取试剂
• 第一链 cDNA 合成试剂盒
• dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM
• Taq DNA 聚合酶

四、操作步骤

1. 总 RNA 的提取：见相关内容。
2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
   1. 在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H₂O 使总体积达 11μl。在管中加 10μM Oligo(dT)12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
   2. 70℃加热 10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1min。
      然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer 2μl；25mMMgCl2 2μl；10mM dNTPmix 1μl；0.1M DTT 2μl 轻轻混匀，离心 42℃孵育 2-5min。
   3. 加入 SuperscriptⅡ1μl ，在 42℃水浴中孵育 50min。
   4. 于 70℃加热 15min 以终止反应。
   5. 将管插入冰中，加入 RNase H 1μl ，37℃孵育 20min，降解残留的 RNA。-20℃保存备用。
3. PCR：
   ① 取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2μl；上游引物（10pM） 2μl；
   下游引物（10pM） 2μl；dNTP(2mM) 4μl；10×PCR buffer 5μl；Taq 酶（2u/μl） 1μl。
   ② 加入适量的 ddH2O，使总体积达 50μl。轻轻混匀，离心。
   ③ 设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
   ④ 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
   ⑤ 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

五、注意事项

1. 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免mRNA 的断裂。

2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

3. 内参的设定：主要为了用于靶 RNA的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢 酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4. PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以 及目标DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单 独实验来确定。

5. 防止DNA 的污染：① 采用DNA 酶处理 RNA 样品；② 在可能的情况下，将 PCR 引 物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。