MRNA 5-甲基胞嘧啶修饰的研究进展：检测、效应、生物学功能和临床意义
5-甲基胞嘧啶(m5C)转录后修饰影响mRNA分子的成熟、稳定和翻译。这些修饰在许多生理和病理过程中发挥着重要作用，包括应激反应、肿瘤发生、肿瘤细胞迁移、胚胎发生和病毒复制。本文对目前mRNA m5C修饰的实验检测方法和预测模型进行了综述，重点介绍了它们的优点和局限性。
作者系统地综述了与mRNA m5C修饰相关的效应物及其在多种物种中的生物学功能的最新研究进展。最后，作者讨论了m5C修饰在多种疾病中的生理作用和病理意义，以及它们的治疗潜力，从而为疾病的治疗和预后提供了新的视角。
介绍
自从20世纪50年代发现了第一种转录后RNA修饰--伪尿嘧啶(ψ)以来，研究人员在RNA水平上探索了潜在的基因调控机制。这个新兴领域被称为“RNA表观遗传学”或“表观转录组学”。与DNA的化学修饰相比，RNA修饰更为丰富，迄今已鉴定出170种，包括N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、N4-乙酰胞苷(ac4C)、N1-甲基腺苷(m1A)、ψ和7-甲基鸟苷酸(m7G)。这些修饰构成了一个相对未被探索的基因表达调节层，突显了RNA的复杂性和多样性。
m5C修饰的研究最初集中在tRNA和rRNA上。在tRNA中，m5C已被证明参与优化密码子-反密码子配对，维持稳态，调节应激反应，控制翻译效率和准确性。同时，rRNA中的m5C修饰在提高细菌耐药性方面发挥着重要作用，胶质瘤对应激相关酶NQO1的生物活性底物的热适应性(例如，核糖体RNA小分子RNA介导的m5C修饰)具有敏感性。虽然关于tRNA和rRNA中m5C的数据很多，但由于mRNA丰度低，缺乏有效的分离纯化技术，对其在mRNA中的作用知之甚少。然而，随着最近检测方法的进步，对mRNA m5C修饰的研究逐渐增加。
检测方法：
目的基因的鉴定是研究mRNA m5C修饰生物学功能的基础。随着测序技术和实验方法的进步，可以在单个核苷水平上对mRNA的甲基化修饰进行定性和定量的分析，为了解其生物学功能提供了新的视角。目前，m5C修改的主要检测方法包括：
Figure 1. 5-methylcytosine (m5C) detection methods based on chromatography and mass spectrometry (MS)
（1）物理化学方法，如色谱、质谱(MS)、高效液相色(HPLC；图1)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS；图1)
（2）化学转化，它结合了下一代测序(NGS)技术，如RNA亚硫酸氢盐测序(RNA-BisSeq)和TEN11易位(Tet)辅助的过氧钨酸盐氧化测序(Tawo-seq；图2)
（3）免疫沉淀与NGS技术相结合，例如具有m5C单核苷酸拆分交联和免疫沉淀的aza免疫沉淀(5-aza-seq；图2)(miCLIP；图2)
（4）基于电信号差异的第三代测序(TGS)(Nanopore-seq；图2)
（5）预测模型，例如用从m5C修饰的侧翼序列提取的特征训练的基于机器学习的m5C预测器(PEA-m5C)、通过伪核苷酸组成的5-甲基胞嘧啶位点(m5C-PseDNC)、Pm5CS-COMP-最小冗余最大相关性(mRMR)、通过伪核苷酸组成识别RNA5-甲基胞嘧啶位点(IRNA-m5C-PseDNC)和m5C-heuristic核苷酸物理化学。这些方法通常用于检测靶基因中的m5C修饰。
Figure 2. Transcriptome sequencing methods after m5C modification
与mRNA的m5C修饰相关的写入器、读取器和擦除器
RNA的PTCM主要涉及三种类型的效应器：
(1) 将特定的化学基团“写入”mRNA的写入器，介导mRNA的修饰。
(2)“阅读”这些mRNA修饰的信息以维持信使核糖核酸稳定，并参与核糖核酸翻译和剪接的读者。
(3)“擦除”mRNA修饰，介导mRNA修饰，并将其转换为未修饰的核苷的擦除器。目前已鉴定的m5C基因的编码者包括NSUN2，NSUN6，TRDMT1，tRNA特异性甲基转移酶4B(TRM4B)和Osnsun2。阅读器包括ALYREF，Y盒结合蛋白1(YBX1)和DNA修复蛋白RAD52同源物(RAD52)(图3)。到目前为止，还没有关于擦除器的报道。
写入器
将m5C写入RNA主要是由两个家族的甲基转移酶完成的，即DNMT家族，即TRDMT1和核仁蛋白1(NOL1)/NSUN蛋白家族，它在人类中有7个成员(NSUN1到NSUN7)。
NSUN2是一种靶谱很广的酶，它首先被发现与tRNA修饰和mRNA甲基化有关。它可以催化甲基与mRNA胞嘧啶的第5个碳原子结合。NSUN2的RNA识别基序和Rossmann-折叠催化核心在催化修饰中起主要作用。它们利用两个半胱氨酸与mRNA中的胞嘧啶之间的共价连接来激活缺少电子的嘧啶杂环。然后，第5号碳原子亲核攻击SAM的甲基，完成甲基化。NSUN2介导的mRNA m5C修饰的主要生物学功能之一是对蛋白质翻译的影响，不同mRNA位点的修饰可以促进或抑制翻译。例如，Xing等人报道称，NSUN2甲基化细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1mRNA)的3ʹ非编码区(C1733)，通过增加核糖体在CDK1mRNA上的组装来增强其翻译能力。
类似的，Wang等人发现NSUN2介导白细胞介素17A(IL-17A)mRNA第466位胞嘧啶的甲基化，以促进其在T淋巴细胞中的翻译，介导同型半胱氨酸诱导的IL-17A表达上调。此外，含有src同源2结构域(SHC)蛋白(p66shc、p52SHC和p46SHC)、p21和ICAM-1(细胞间粘附分子1)的表达增加与NSUN2介导的mRNA M5C修饰之间的相关性已被报道。Tang等人报道，NSUN2通过修改p27mRNA 5’UTR中的C64甲基化(M5C)来抑制p27翻译。同样，Mei等人发现NSUN2介导的mRNA 3’UTR中的M5C修饰抑制了p57Kip2的表达。Schumann等人的研究表明，编码序列(CDS)区域M5C修饰的丰度与mRNA翻译效率呈负相关，而3’UTR区域的甲基化增强与mRNA翻译效率呈正相关。因此，NSUN2在M5C修饰中的作用可能与甲基化的位置或特定修饰的靶基因密切相关。Fang等人利用CRISPR整合的gRNA和报告测序(CIGAR-SEQ)发现了一种新的mRNA M5C甲基转移酶NSUN6，这是一种基于CRISPR-Cas9的无偏见筛选新的mRNA修饰效应的方法。
TRDMT1是另一种调节mRNA甲基化并抑制HEK293细胞增殖和迁移的RCMT，可以催化tRNA中的m5C修饰。这表明TRDMT1具有与NSUN2相似的靶向谱，m5C甲基化酶可以修饰多种类型的RNA。因此，需要进一步的研究来确定在不同的时空状态和RNA物种中，哪些甲基化酶介导m5C甲基化。与NSUN2不同，TRDMT1的甲基化只在单个位点使用半胱氨酸。由于M6A是真核细胞mRNA中最常见的修饰类型，许多甲基化酶被报道催化M6A安装。有人发现某些m5C位点在NSUN2基因敲除或敲除细胞系中保持高甲基化水平。此外，这些m5C位点与依赖于NSUN2的m5C位点具有不同的序列和结构特征，这表明未知的甲基转移酶参与了m5C位点的催化作用，而不依赖于人mRNA中的NSUN2。总体而言，M6A编写者的多样性表明仍有大量的m5C甲基化酶有待发现。
有趣的是，一些研究已经将m5C和M6A联系起来。例如，在氧化应激诱导的细胞衰老过程中，NSUN2介导的m5C和由METTL3/METTL14介导的m6A在翻译水平上相互促进并协同增强p21的表达。有人发现NSUN2作用于p16 mRNA的988thadnine产生m6A修饰，提示NSUN2是mRNA的m6A甲基转移酶。此外，人类癌症中m6A和m5C调节因子之间的串扰已经被提出。然而，它们与mRNA功能调控相关的确切相互作用仍不清楚。确定除m6A和m5C之外的其他类型的修饰是否也相互作用也很重要。作者推测，这些课题可能会成为未来的研究热点。
阅读器
阅读器蛋白在mRNA中m6A修饰进行了广泛的研究，发现其在mRNA的剪接、输出、稳定和翻译中发挥作用。相对于mRNA m6A阅读器的研究，对mRNA m5C阅读器的研究还处于早期阶段。例如：ALYREF在mRNA的核质输出中起作用；作为阅读器，它通过K171(171位的赖氨酸)特异性地与m5C修饰的mRNA结合，调节mRNA的输出。同时，YBX1参与了m5C修饰的mRNA的稳定。此外，RAD52对含有m5C修饰的RNA和DNA(互补的RNA对)的杂交链有更高的亲和力，表明它是一种是DNA损伤位点的m5C读取器。最后，RAD52通过TRDMT1-m5CRAD52-RAD51轴促进活性氧诱导的DSBs的非典型HR修复。
擦除器
在RNA去甲基酶的介导下，如肥胖相关蛋白(FTO)和AlkB同系物5(ALKBH5)，mRNA m6A修饰的可逆性已被证实。早期的研究发现了一条与DNA的m5C修饰相关的去甲基化途径，即在DNA修饰过程中，m5C被Tet氧化成5-羧基胱氨酸(5caC)，然后被胸腺嘧啶-DNA糖基化酶切割，从而完成DNA的脱甲基化修饰。有人报道了TET2可以介导mRNA m5C的氧化。而在小鼠细胞中，hm5C的mRNA水平低于m5C，TET2蛋白的存在不会增加hm5C的mRNA含量。因此，未知蛋白可能会将hm5C重新转化为m5C，提示m5C修饰可能有可逆的擦除。
Figure 3. Overview of the effectors (writers, readers, and erasers) related to m5C modifications of mRNA
mRNA m5C修饰在疾病中的作用
癌症
多个调节m5C修饰的mRNA m5C效应器已被确定为参与癌症的发生和发展(图4)。具体地说，m5C通过调节mRNA的稳定性、表达和翻译，在癌细胞的增殖和转移以及肿瘤干细胞的发展中发挥重要作用(表1)。Chen等人发现YBX1通过冷休克结构域(CSD)上的W65吲哚环识别m5C修饰的mRNA，并招募ELAVL1(ELAVlike Protein 1)来稳定HDGF(肝素结合生长因子)mRNA，最终促进膀胱癌细胞的增殖和转移。Zhang等人发现肝癌组织中mRNA m5C甲基化峰数明显高于癌旁正常组织，不同部位基因分布有显著差异。这些结果提示肝癌的发生发展与mRNA m5C修饰有关。m5C相关效应分子NSUN4和ALYREF的高表达与肝细胞癌(HCC)患者预后不良相关。虽然具体的潜在机制尚不清楚，但这些结果表明m5C基因的修饰与HCC的发生、发展和预后密切相关。
此外，据报道NSUN2在胃癌组织中的表达明显高于癌旁的正常组织，并可能通过抑制p57Kip2的表达而促进胃癌细胞的增殖，这可能是一种m5C依赖的方式。总而言之，这些研究表明，mRNA m5C修饰在某些癌症中起作用；然而，m5C是否参与其他癌症的发生和发展还需要研究。应该指出的是，只有少数研究报道了mRNA m5C修饰与癌症之间的联系，其中大部分集中在NSUN2上，而没有证据表明NSUN2通过调节m5C修饰而与癌症的发生或进展有关。Gao等人发现NSUN2的高表达可以通过与核糖体蛋白L6密切合作促进胆囊癌细胞的增殖和肿瘤的发生。应用免疫组织化学方法，Yi等人报道NSUN2的表达与乳腺癌的临床分期、肿瘤分类和病理分化有关。此外，NSUN2的低甲基化导致其过表达，从而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在头颈部鳞癌、口腔癌和结直肠癌中，NSUN2的上调也与预后不良有关。
相比之下，其他研究报告称，该基因在小鼠体内的缺失增强了肿瘤启动细胞的自我更新能力，从而促进了皮肤癌的发生。此外，NSUN2在皮肤癌中的过度表达与疾病的恶性程度呈负相关。因此，某些问题仍然存在，需要进一步调查。在不同的癌症中，重要的是要确定NSNU2是否通过调节特定的致癌或抑癌mRNA来调节癌症的进展。此外，验证NSUN2是否通过调节m5C修饰在癌症的发生和发展中起作用也是必要的。m5C修饰和它的效应物，如NSUN2和YBX1，参与了多种癌症的发生和发展，为疾病治疗提供了新的靶点。例如，在乳腺癌中抑制鞘氨酸激酶(SPHK)可以减少NSUN2的表达，这表明SPHK1是一个潜在的乳腺癌标记物。YBX1磷酸化抑制剂TAS0612(多激酶抑制剂)和维罗莫司(雷帕霉素复合物1抑制剂)作为阅读器，可以克服进展性乳腺癌细胞对雌激素的耐药性。然而，YBX1抑制剂在乳腺癌治疗中的作用是否与m5C修饰的调控有关还有待阐明。
尤其是mRNA m5C相关效应物是否可以作为预测肿瘤预后的标志物，以及它们的抑制剂与常规化疗药物联合使用是否能代表有效的抗癌策略，还有待证实。同时，DNA修饰在调节肿瘤干细胞的特性方面起着重要作用。例如，调节酶的抑制剂：组蛋白去乙酰化酶抑制剂，例如Vorinostat，以及DNMT的抑制剂：azacitidine、decitabine和SGI-110，正在进行治疗多种癌症的药物临床试验。因此，增加对mRNA m5C修饰的了解，可能有助于改善癌症的诊断、治疗和预后。
自身免疫性疾病
先前，作者发现系统性红斑狼疮(SLE)患者CD4+T细胞的5-甲基胞嘧啶/胞嘧啶(m5C/C)比值低于健康对照组。m5C修饰在SLE患者和健康人mRNA中的分布高度保守，主要集中在mRNA翻译起始点附近。免疫系统中SLE高甲基化和上调的基因富集，富集的通路包括细胞因子和干扰素信号通路。此外，作者观察到SLE患者NSUN2和m5C修饰的下调。然而，在SLE患者中，许多基因发生了高甲基化，这表明存在其他m5C甲基化酶。例如，IL-17A是许多自身免疫性疾病的重要介质。在大鼠T淋巴细胞中，NSUN2通过其C466位点甲基化来促进IL-17A的翻译；然而，尚不清楚IL-17A mRNA的m5C修饰是否与免疫疾病有关。SLE的mRNA m5C修饰在SLE缓解和复发中的具体机制也不是很清楚。要解决这些问题，还需要进一步的研究。
血管内皮炎
Luo等人发现，NSUN2通过上调ICAM-1mRNA甲基化来促进ICAM-1的表达，从而改善白细胞与内皮细胞之间的粘附，促进血管内皮细胞炎症，这是动脉粥样硬化、高血压、再狭窄和缺血/再灌注损伤等多种血管疾病发病的关键因素。此外，供体NSUN2的缺乏阻碍了同种异体主动脉移植大鼠模型移植物动脉硬化的形成，这提示NSUN2-ICAM-1调节轴参与了血管内皮细胞炎症。除ICAM-1mRNA外，NSUN2还可催化其他mRNA和非编码RNA的甲基化。因此，NSUN2调控血管炎症和动脉粥样硬化发生发展的机制有待进一步研究。
Figure 4. The mRNA m5C modification associationswith tumorigenesis and metastasis in multiple cancers.
临床相关性和未来发展方向
RNA甲基化的临床相关性可能成为未来几年的研究热点。然而，目前对mRNA m5C修饰的临床效应的研究主要集中在肿瘤性疾病上，对非肿瘤性疾病的研究较少(表1)。因此，在未来的研究中拓宽疾病的类型将促进作者对m5C感染的临床后果的理解。此外，mRNA甲基化可能是特定疾病进展过程中一个潜在的生物标志物。因此，有必要开发新的技术来快速识别引起疾病状态的修饰，并量化与这些修饰相关的蛋白质水平。进一步探讨m5C修饰在免疫应答中的作用，将为肿瘤免疫治疗和肿瘤耐药提供更广阔的前景。在疾病治疗的背景下，研究能够靶向m5C分化相关效应蛋白的小分子抑制剂可能是一个很有前途的研究方向。随着这些靶向药物的临床前疗效的显现，RNA表观遗传药物的开发将进入一个新的时代。
全文小结
M5C修饰已在多种生物中被检测到，并在人类和植物中发挥独特的生物学功能，具有某些共同特征。它富含tRNA、rRNA和mRNA，影响RNA的稳定性、翻译保真度、细胞分化、神经系统调节、生殖系统发育、和病毒活性。因此，M5C修饰对于理解多种生理和病理过程非常重要。
更多精彩文章解读尽在生信人公众号
网友评论