本文选自nature communication,https://doi.org/10.1038/s41467-020-15109-y,喜欢的朋友可以自行下载阅读。
摘要:铁死亡是一种由铁依赖的脂质活性氧积累介导的调节性细胞死亡的新的特征性形式,具有巨大的癌症治疗潜力。然而,铁死亡的分子机制在很大程度上仍然难以捉摸。在本研究中,我们定义了DJ-1在铁死亡中的整合作用。抑制DJ-1在体外和体内都能有效地增强肿瘤细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。代谢分析和代谢物挽救分析表明,DJ-1的耗竭通过破坏S-腺苷同型半胱氨酸水解酶四聚体的形成和降低其活性来抑制跨硫途径。因此,当同型半胱氨酸的生成减少时,会诱导更多的铁死亡,这可能是胱氨酸摄取受阻时谷胱甘肽生物合成的唯一来源。因此,我们的研究结果表明,DJ-1决定了癌细胞对铁死亡的反应,并突出了潜在改善基于铁死亡的抗肿瘤治疗效果的候选治疗靶点。
DJ-1作为体内的抗氧化剂在应对细胞氧化应激时发挥重要作用,然而大多数研究是围绕细胞内活性氧的研究,DJ-1对于脂质过氧化物的影响还没有研究,作者就做了此类的研究内容。
首先是观察DJ-1是不是影响了铁死亡诱导的敏感性问题。发现应用铁死亡诱导剂后,会显著增强DJ-1 KD细胞对铁死亡的敏感性,并进一步证明了erastin诱导的细胞发生铁死亡。
作者进一步做了挽救实验证明在erastin诱导下引起细胞铁死亡,应用CRISPR/Cas9的KO技术形成DJ-1亚克隆,发现同样DJ-1的KD增强了erastin的敏感性。
作者进一步看了异位过表达DJ-1是否可以抵消erastin引起的铁死亡,在铁死亡敏感的细胞系(H1299、A2780、786-O和KHOS)并没有观察到这种现象,但是在MEF细胞中异位过表达DJ-1抑制了诱导的铁死亡。因为DJ-1常常发生突变,在肿瘤组织中也存在,是否这些突变也起到了类似作用呢,作者进一步研究了一下,发现这些突变体并没有起到抵抗铁死亡的作用。这表明DJ-1的铁性下垂阻断作用需要其正常的功能。
接下来该探索机制的问题了,因为以前研究发现DJ-1可以通过抑制KEAP从而发挥稳定NRF的作用,作者看了看NRF是否为DJ-1的下游效应分子。发现敲减DJ-1可以显著促进erastin诱导条件下的NRF的表达。结果在敲了DJ-1以后并没有表现出NRF下游的分子表达降低,反而在erastin诱导下升高了。说明在DJ-1 KO以后,NRF被激活了。为了研究这两个对铁死亡的影响,将这两个基因双敲除,发现可以明显促进erastin诱导的铁死亡过程。感觉这是文章的一个隐患,如何知道一定是DJ-1而不是NRF在下游机制中起到作用。
接下来还是找DJ-1的靶点问题,作者用了四种铁死亡诱导剂,发现直接靶向GPX4的补充DJ-1不能挽救铁死亡表型,所以就定位于GPX4上游。然后就看看其他靶点SLC7A11,但是,没有发现差异,还发现DJ-1KD不影响细胞内半胱氨酸水平,所以排除了Xct改变引起的铁死亡敏感性改变。紧接着作者把重心调整到细胞内主要的氧化还原成分GSH上,猜测DJ-1可能影响到了GSH的合成。接着就是找GSH关键酶的表达变化——谷氨酸-半胱氨酸连接酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(Gss)。但是在KD的细胞中并没有发现两个酶的变化,所以作者又转向了转硫途径生成GSH,当添加L-同型半胱氨酸(Hcy)处理细胞时,我们观察到Hcy逆转了对照组和DJ-1KD H1299细胞中Erastin诱导的脂质ROS积聚,作者怕大家看不懂转硫途径对的具体调控过程,上了一个模式图,结果发现在给予半胱氨酸同时给予γ-GCS抑制剂丁硫醚亚砜(BSO)共同处理,可以逆转HCY的作用。给予转硫途径的这几个产物,发现只有hcy可以改变DJ-1敲除后的铁死亡敏感性改变。针对这个转硫途径的几个酶进行PCR,发现KO组,erastin诱导后清一色升高,有个MAT下降了,但也说明这些酶的表达并没有受到影响。
依据上面得到的结果,作者检测了DJ-1敲除后的HCY表达情况,用的是ELISA,发现这敲除后明显下降,补充DJ-1可以恢复HCY的含量,为了证明是SAH到HCY这个过程被DJ-1敲除后抑制,作者应用了不含MET的培养基,当加入SAH后HCY在敲除的细胞中并没有明显改变,当补充DJ-1后HCY再添加SAH后明显升高,以上说明了DJ-1通过影响HCY的合成从而改变了铁死亡的敏感性。
通过检测SAHH的活性发现敲除后明显抑制了SAHH的后行,然后添加DJ-1后可以恢复,所以作者敲除了SAHH,发现敲除后细胞对erastin敏感性升高,敲除DJ同时添加SAHH可以减轻脂质过氧化。
那么DJ是如何影响SAHH呢?通过对mRNA的检测发现敲除后升高,并没有影响RNA水平,蛋白水平改变也不大,因此作者推断DJ-1通过影响蛋白质的修饰,从而发挥效应,但是对报道的修饰乙酰化及磷酸化水平都没有改变,表明DJ-1可能通过另一种伙伴蛋白间接影响SAHH的活性,用邻近依赖生物素鉴定(BioID)的方法,重点研究了与DJ-1的相互作用蛋白,发现了123个被DJ-1特异性结合的蛋白,作者找到了AHCYL,
紧接着就是做AHCY与DJ-1直接结合的实验,其中AHCY包含L1和L2两种亚型,已经证明SAHH是一个四聚体,辅因子NAD+/NADH结合在每个亚基上,AHCYL和SAHH的异构体可以降低SAHH的活性。因此,推测DJ-1改变了AHCYL(AHCYL1或AHCYL2)和SAHH的异构体的形成,进而影响了SAHH的四聚反应。通过DJ-1-FLAG转染的高水平DJ-1减弱了AHCYL1和SAHH之间的相互作用,而DJ-1沉默增加了它们的异构化。然而,AHCYL2和SAHH之间的相互作用并没有随着DJ-1表达的操作而显著改变。所指示的DJ-1KD H1299细胞中脂质ROS产生的增加只有在同时AHCYL1沉默之后才被抑制,但在AHCYL2沉默之后不会被抑制,证实DJ-1对SAHH活性的调节是由AHCYL1介导的。利用成熟的蛋白质交联剂琥珀酸二丁二酰亚胺(DSS),我们能够检测到四聚体SAHH复合物和单体亚单位。值得注意的是,DJ-1KD显著损害了SAHH四聚体的形成。与此相一致,用尺寸排斥色谱法观察到DJ-1KD细胞中的四聚体SAHH复合物显著受损(图6G)。此外,DJ-1的过表达也增加了HEK293T细胞中四聚体SAHH复合物的形成。
做完机制以后,开始体内实验了。发现敲除后对ERASTIN敏感增加并且肿瘤抑制。
好了,文章结束,机制做的很好,就是太基础,不甚明白,欢迎批评、指正。
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