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最新10+干湿结合好文,单细胞识别恶性代谢通路+建模+核心基因实

最新10+干湿结合好文,单细胞识别恶性代谢通路+建模+核心基因实

作者: 生信小课堂 | 来源:发表于2024-07-22 22:20 被阅读0次

研究概述:癌症的特点是细胞无限制增殖,并通过重编程代谢过程在不断变化的微环境中生存。丝氨酸-甘氨酸-单碳(SGOC)代谢网络包括丝氨酸-甘氨酸生物合成、叶酸和甲硫氨酸循环以及嘌呤核苷酸生物合成,这些过程形成了一个正反馈回路,可以满足癌细胞的多种需求。此外,SGOC代谢的产物和中间体可以在肿瘤微环境中影响免疫细胞,如环状二核苷酸在癌症免疫治疗中起着重要作用。并且,SGOC代谢代表了活跃肿瘤的一个特点,越来越多的证据表明,高度增殖的癌细胞表现出SGOC代谢酶的增加表达。因此,SGOC代谢酶可成为未来癌症治疗的潜在治疗靶基因。头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是世界上第七大常见癌症,具有高度的异质性和死亡率。尽管近年来多模式治疗策略显著改善了疗效,但仍有不到60%的患者达到5年生存率,而在接受免疫检查点阻断治疗的晚期患者中,反应率不到20%。作者考虑到代谢在肿瘤发生和发展的核心作用,便通过单细胞RNA测序分析揭示了HNSCC的代谢异质性,构建基于SGOC的预后模型,评估其对患者临床结局的预测能力,并结合相当的湿实验工作量,探讨新型代谢靶向药物的抗肿瘤疗效。具体流程如下:

研究结果:

SGOC上调是HNSCC的重要代谢特征

作者对20名HNSCC患者的单细胞RNA测序数据进行了分析,将47,711个细胞分为不同的细胞类型:上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞、免疫NK/T细胞、B/浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞等。为了阐明HNSCC的代谢重编程,作者选择了非恶性和恶性上皮细胞(图a),结合单细胞数据和转录组数据,分别计算114个代谢通路的表达评分在两种细胞的表达。与非恶性上皮细胞相比,恶性上皮细胞中有100个代谢通路差异表达,其中64个上调/36个下调(图b)。其中,在恶性细胞中SGOC代谢网络内的丝氨酸-甘氨酸、叶酸、嘌呤、嘧啶和甲硫氨酸代谢通路显著上调(图c, d)。为了进一步描绘SGOC代谢的重编程,作者量化了SGOC代谢的表达评分,结果发现SGOC及其分支的代谢通路在恶性细胞中的表达均高于正常细胞(图e, f)。此外,单变量COX回归分析和KM生存分析均表明:SGOC评分较高的HNSCC患者的总生存时间比评分较低的患者短(图2h)。因此,SGOC的上调可能代表HNSCC中的一种显著代谢紊乱,并与不良临床结局相关。


高SGOC代谢促成HNSCC的侵袭性表型

为了评估HNSCC细胞的SGOC代谢异质性,作者基于SGOC表达状态将HNSCC重新分类为五个亚群(C0 - C4,图a)。不同患者的HNSCC细胞亚群组成差异很大(图b, c)。作者使用GSVA计算每个亚群的SGOC评分,发现每个亚群表现出不同的SGOC评分,这同样突显了HNSCC内的SGOC代谢异质性(图d, e)。作者基于GSEA分析发现,具有较高SGOC评分的亚群(C1, C2和C4)与较高的细胞周期标志相关(图e);而相关性分析同样表明SGOC通路的评分与细胞周期标志呈正相关(图f)。此外,KEGG富集分析表明具有高SGOC评分的亚群富集在肿瘤相关通路:糖酵解和HIF-1信号通路(C1)、核苷酸代谢(C2)和核质运输(C4)(图g)。最后,作者在4个转录组数据集中(TCGA-HNSCC、GSE41613、GSE65858和GSE42743)探究了4种不同细胞亚群比例,和单细胞数据一样,C0和C2亚群占比较大(图h)。最后,作者为了确定哪个亚群与不良临床结局相关,进行了单变量COX和KM生存分析。结果表明,高C0(低SGOC评分)患者的总生存时间较长,而高C2(高SGOC评分)患者的总生存时间较短(图i-j)。


构建SGOC相关的风险模型评分

上文提及,作者发现SGOC代谢在HNSCC细胞中起到重要作用,于是便构建一个基于SGOC的预后评分。通过对恶性和正常细胞间的差异表达基因与SGOC相关基因取交集,作者共鉴定出68个差异表达的SGOC基因(图a)。通过单变量COX分析筛选出了16个与总生存期OS相关的基因(图b-c)。随后,作者把499名TCGA-HNSCC患者随机分为训练组(n=250)和测试组(n=249)。基于这16个候选基因进行了LASSO回归分析建立了一个基于4个基因的SGOC风险评分模型。不管在在训练组、测试组还是TCGA-HNSC整体队列中,高风险组患者的OS和无病生存期DFS较低风险组患者短(图d, e)。在外部队列(GSE65858,n=270;GSE41613,n=97;GSE42743,n=74)得到了类似的验证:高风险组患者的临床结局较差(图f)。此外,作者在接受化疗的HNSCC患者中发现高SGOC风险评分组患者在化疗后OS较长(图g)。同时,作者验证了高风险患者的SGOC评分较高(图h);在不同队列中SGOC风险评分同样与细胞周期呈正相关(图i)。此外,高风险患者的癌症信号通路和癌症标志物进一步加剧,例如上皮-间质转化EMT、糖酵解、血管生成、DNA修复、TGFβ信号、mTORC1信号、MYC和E2F靶标(图j)。


SGOC代谢与免疫细胞浸润关系

随后,作者探讨SGOC风险评分与免疫尤其是TME之间的关系。首先,作者发现SGOC风险评分与免疫评分、基质评分、微环境评分和淋巴细胞浸润呈负相关(图a)。低风险患者显示出更高的免疫评分、基质评分和微环境评分(图b)。CIBERSORT和MCPcounter分析提示与高风险组相比,低风险组的TME中免疫细胞浸润更多,包括CD8+ T细胞和滤泡辅助T细胞(图c)。然而,低风险肿瘤中高表达的免疫检查点抑制剂PD-1、HHLA2和TIGIT,暗示低SGOC风险评分患者的TME特征是耗竭的T细胞浸润(图d)。作者根据SGOC风险评分,进一步将HNSCC分为SGOC低、中或高三组(图e)。低SGOC与SGOC高的HNSCC之间差异表达基因显著富集于与免疫相关的生物功能,如T细胞激活、T细胞介导的免疫反应等(图f)。为了进一步验证HNSCC与T细胞之间的相互作用,作者把T细胞单细胞数据细分为CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、初始T细胞、循环T细胞和NK T细胞。与SGOC中或高组相比,SGOC低组对T细胞具有更强的趋化作用,这表明TME中的SGOC低细胞主要吸引T细胞(图g)。同样地,恶性细胞的SGOC风险评分与免疫细胞和CD8+T细胞浸润呈负相关(图h, i)。最后,作者利用两个免疫治疗队列(PRJNA482620和PHS000452),通过KM生存分析证实,接受抗PD1/PD-L1免疫治疗中,低风险组患者的OS优于高风险组患者(图j, k)。


IMPDH1是诱导HNSCC的SGOC代谢靶点

接下来作者开始进行湿实验验证,确定潜在的治疗靶点以及高低风险组之间的潜在代谢机制。作者首先发现22条代谢通路在高风险患者中上调,其中嘌呤合成通路最为显著(图a)。既往文献表明:IMPDH1是新生嘌呤合成的限速酶。作者发现其在高风险组中显著上调(图b)。然后,作者使用IMPDH泛抑制剂(MPA、MMF)抑制HNSCC细胞的IMPDH1活性,以评估其抗肿瘤效果。CCK8实验显示,MPA/MMF处理显著降低了HNSCC细胞的活力(6c, d)。EDU实验同样证明了MPA对癌细胞增殖的抑制作用(6e)。此外,流式发现MPA处理后增加了G0/G1期细胞的比例,同时减少了G2/M期细胞的比例(图f)。随后的WB和流式提示了MPA科增加了HNSCC凋亡的比例和凋亡标志物(cleaved-PARP,cleaved-caspase-9,细胞色素c)的表达(图g, h)。最后划痕实验和Transwell显示,MPA显著抑制了HNSCC的迁移和侵袭能力(图i, k)。


抑制IMPDH1通过触发GTP耗竭核仁应激抑制HNSCC细胞的进展

为了进一步研究IMPDH抑制剂在HNSCC中的抑癌效果,作者探讨了其潜在机制。既往文章表明,IMPDH1可通过生成用于DNA复制和RNA(mRNA、tRNA和rRNA)转录的嘌呤核苷酸来支持细胞增殖(图a)。同样,高SGOC和低SGOC的HNSCC之间的差异表达基因也富集在嘌呤核苷酸合成和细胞周期中(图b)。然后,作者使用液相色谱检测了MPA处理后的ATP和GTP含量,结果证实MPA显著抑制了GTP的生成,而对ATP的抑制较弱(图c)。在MPA处理后,HNSCC细胞的核仁严重缩小,表明诱发了核仁应激(图d)。通过已有知识,核仁应激的特征是核仁形态和功能的改变,并引起分子变化,包括NPM1和GNL3的降解和定位改变以及p53的稳定,这反过来促使细胞周期停滞或凋亡通路的激活。作者通过WB证实,MPA处理降解了核仁蛋白(NPM1和GNL3),并增加了p53的水平,这支持了MPA介导的新生嘌呤合成抑制诱发的核仁应激(图e)。因此,作者做了恢复实验:在MPA处理的HNSCC细胞中添加外源性鸟苷以抵消IMPDH抑制剂的效果。CCK-8显示:MPA抑制的细胞活力可被外源性鸟苷rescue(图f)。此外,由MPA诱导的核仁蛋白(NPM1和GNL3)改变可被鸟苷补充逆转,表现为NPM1和GNL3重新定位到核仁(图g)。


作者建立了稳定敲低IMPDH1的HNSCC细胞进一步验证。全部的功能实验表明,敲低IMPDH1的HNSCC细胞与与上文MPA处理的作用类似,IMPDH1敲低抑制了HNSCC细胞的活力、迁移、侵袭,并诱发了GTP耗竭核仁应激和凋亡。并且,这些IMPDH1敲低的效果都可以被外源性鸟苷的补充逆转(图8)。


动物模型验证

作者通过使用裸鼠的皮下肿瘤模型来确定IMPDH抑制剂对HNSCC生长的体内作用。在接受了两周的MMF治疗后,与对照组的肿瘤相比,MMF治疗的肿瘤生长速率较慢,肿瘤体积较小,重量也较轻(图a-c)。并且,两组小鼠的体重没有显著差异,这表明MMF治疗的副作用发生率较低(图d)。此外,免疫组化结果提示:与对照组相比,MMF处理组显示NPM1水平降低,而P53和细胞色素c水平升高(图e)。最后作者在免疫健全鼠建立了HNSCC皮下模型,以评估MMF对抗肿瘤的影响。经过两周的MMF治疗, MMF显著减缓了肿瘤生长,肿瘤体积和重量均减少,而对体重没有显著影响(图f-i)。


研究总结:

个人觉得这篇文章目前是干湿结合比较出色的范文。这篇文章首先通过生信分析,研究了SGOC代谢在HNSCC中的作用。研究通过单细胞和bulk转录组分析,揭示了HNSCC中SGOC代谢的异质性及其对预后和治疗的影响。难能可贵的是,作者在确定IMPDH1是一个关键的靶点后,做了相当工作量的体内外实验。包括用药物抑制/稳定敲低IMPDH1,发现其能够显著抑制HNSCC细胞的增殖和迁移,诱导细胞凋亡。作者还揭示了抑制IMPDH1导致GTP耗竭,引发核仁应激,从而抑制肿瘤细胞的进展。这一机制在细胞和动物模型中均得到了验证;并在体内实验(裸鼠和免疫健全)中显著抑制肿瘤生长。总的来说这篇文章工作量不仅体现在干湿结合上,湿实验的细胞到动物的工作同样值得学习。


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