2019年1月16日，星期三，晴
今天起床比较早，出门也比较早。跟研究所HQY老师商量了能不能再买冰箱，冰箱6能否借用等系列问题。
跟SZM同学要的食管细胞又是没能拿到，有点遗憾！一大早他师弟LZ给我发消息说细胞状态不好，不排除污染可能，今天就没办法拿了。我赶紧联系DF同学，让她不用过去了。
去了中心实验室，把细胞培养专用箱整理了一下。由于早上乳腺科处理血清，占用4℃离心机，也就没办法提组织RNA了。又因为我预约超净台的时间是14：30-17：30，所以也没办法处理细胞。（在此感谢厦门师弟WZG，一大早还打电话关心细胞的生长状态）
师弟HY和YXH相继来实验室找我，一个是来探讨毕业论文的事宜，一个是来探望我。
泌尿外科ZB，早上准备进行q-PCR上机，需要我协助他上机操作。我这就凭借自己的三脚猫功夫勉强指导了一下。可是他进行的是miRNA，和一般的mRNA在方法上不大一样，机器一直报故障，请中心实验室的老师来指导，结果也不行，最后还是产家协助搞定。
在此间隙，我再次提取了组织RNA，这次比昨天那次更流畅了，提出来RNA的浓度是800，纯度1.86。（不放心，又去超微量分光光度仪上测了一把，浓度也是800，纯度是1.88，但还是出现了三角形标志，提示RNA不够纯，查看原因是胍类比较多，请教了YRL同学，她给的建议和WZG师弟一样，建议用酒精多洗一遍）。于是下午我提取了第3个组织RNA，这次结果就非常满意，浓度900，纯度1.89，没有三角形标志，真是太开心了。我想明天可以准备进行RT-PCR和q-PCR，毕竟新的引物已经回来了。
TRIZOL法提组织RNA
1、组织匀浆
（1）取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg组织置于研钵内，剪刀剪碎。
（2）加入600ul的TRIZOL，研磨，直至不见组织碎块，呈匀浆状。加入400ulTRIZOL淋洗研钵。
（3） 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离
加入0.2 ml的氯仿，加盖好后涡旋震荡15秒，在15- 30°C放置2-3分钟后离心4℃，12,000rpm，15 minutes 。离心后分成三层,，下层的红色为组织沉渣及酚-氯仿相，中间层为蛋白和DNA，上层是无色的水相，RNA 只存在于水相中。水相占总TRIZOL的40-60%。
3、RNA沉淀
将上层水相转移到另一干净的EP管中，（注意宁少勿多，不要取到中间层），加入0.5ml异丙醇，室温静置10 minutes ，然后离心4℃，12,000 rpm，10 minutes。离心后可以在管的侧壁和底部看到白色沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤
去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心，4℃，12000rpm，5 minutes。（可重复多次，彻底洗去有机溶剂）
5、RNA再溶解
去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀。（注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度，部份溶解的RNA样品其A260/280 比值< 1.6。）
用无RNase 水（DEPC）20-50ul重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60°C。测浓度后-20°C保存。
6、测浓度：以无RNase水（DEPC）作空白对照，测OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml 较准。浓度太高要稀释以后再测定。
下午给140和510换液，里面有许多漂浮的小点点，可晃动，和上回不一样，给他们认真换了液，期待明后天传代会有好的结果。het细胞状态很好，冻存了4管，并其中一瓶T25细胞按1：3传代。
晚上和几个师弟一起吃饭，互通有无，挺好的！
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