尽管二维凝胶电泳（2D PAGE）作为一种解决复杂蛋白质混合物的方法优于其它方法，该技术仍存在一些问题。首先是难以进行完全可重复的二维凝胶电泳2D PAGE分析。当希望使用二维凝胶电泳2D PAGE通过比较染色凝胶的图像来比较两个样品时，这个问题就变得尤为重要。蛋白质在两个维度上的迁移差异可能被误认为是两个样本之间某些蛋白质水平的差异。
使用二维凝胶电泳2D PAGE的第二个问题是一些蛋白质与第一维等电聚焦IEF步骤的相对不相容性。许多大的、疏水性的蛋白质在这类型分析中表现不佳。边际溶解度使蛋白质沉淀和聚集，从而导致蛋白质在IPG条带内“胡乱涂抹”，而不是干净地聚焦成离散的条带。当这些蛋白质随后在第二维度（SDS PAGE）中运行时，在分子量区域上显示为条纹状（如图1）。由于出发点不同，相关问题有时被视为2D PAGE的优点，有时又被认为是缺点。蛋白质的等电聚焦IEF由于存在具有不同等电点的多种蛋白质形式，常常将蛋白质分解成多个离散的条带。例如，将中性酰胺转化为阴离子羧基的脱酰胺作用可以改变蛋白质的pI及其在IPG条带中的迁移。其他可能影响pI的修饰包括糖基化、磷酸化、氧化和外源性化学修饰。在某些情况下，同一多肽的不同修饰变体可能出现斑点“序列”（如图2）。尽管这种分辨率有助于确定存在哪些不同形式的蛋白质，它也会使利用二维凝胶电泳2D PAGE预估两个样品中相对蛋白质表达的问题复杂化。
图1.二维凝胶切片，蛋白质水平方向的“胡乱涂抹”。
图2.一种二维凝胶的切片，由于同一蛋白质的不同修饰/带电形式而形成的“斑点序列”。
使用二维凝胶电泳2D PAGE的第三个问题是作为检测技术使用的蛋白质染色的动态范围相对较小。点密度最多只能反映100倍的蛋白质浓度范围。这意味着2D凝胶的染色可以使丰富的蛋白质可视化，而不太丰富的蛋白质通常无法被检测到。
Steven Gygi和Ruedi Aebersold的一项研究就是个很好的例子。他们研究的是酵母中基因表达（通过mRNA转录测定）和蛋白质水平（通过加入放射性标记的蛋氨酸来测定）的关系。酵母表达了约6000多个基因中的三分之二，但经过银染色结合2D PAGE分析，最多测出了约1000个蛋白质。换句话说，在使用2D PAGE分析中，4000个表达基因中有3000个未被检测到。检测到的大多数蛋白质都是密码子偏倚值高的基因产物，因此具有较高的表达趋势。因此，2D PAGE是分析大量蛋白质和生命周期较长的蛋白质的最佳方法。然而，许多在生物学上有相当大价值的蛋白质的表达水平相对较低，并且很快被转化。对于这些蛋白质的蛋白质组分析，需要用到其他的分析方法。
本文由百泰派克生物科技整理编辑，未经许可，不得转载。
百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务，结合亲和纯化与Label-free、SILAC或SWATH定量技术，开发了一系列蛋白质组研究策略，其灵敏度高、重复性好，非常适合蛋白质相互作用的研究。
网友评论