做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。
一、简单验证
目标基因DNA甲基化的验证：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）
DNA甲基化干扰：
DNA甲基化酶的敲降/敲除/过表达
DNA甲基化抑制剂
阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。
检测整体DNA甲基化变化：
5mC甲基化免疫荧光染色（定性）
DNA斑点杂交（定性）
比色法（定量）
]质谱法（定量）
检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证
目的基因DNA甲基化的干扰：
荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基转移酶在体外将质粒进行甲基化，构建含甲基化/未甲基化启动子的目标基因-荧光素酶表达质粒。
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。
检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
检测细胞功能受到的影响:
免疫荧光显微观察
功能标志物测定
... ...
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术
目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序）
靶向特定区域进行超高深度甲基化测序。
超高深度：可达几百到几千乘。
单个区域长度<300bp
需要设计BS引物，进行预扩增实验。
WGBS vs. TBS相当于RNA-seq vs. RT-qPCR
参考文献：
① Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)，DOI10.1186/s13148-017-0430-7
② Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0841
③ Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns，doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z
网友评论