一、项目设计
- 测多少数据量？
- 几个生物学重复？
- 混池测序是否性价比很高？
- 参考序列怎么选？
二、分析方法
- 转录本拼接
- 比对的两种模式
- 表达定量
- FPKM，RPKM，TPM，TMM
- 差异表达分析
1. 什么是基因组？
物种、亚种、个体、单细胞都可以测基因组。基因组是指一个细胞或者一个生物的完整序列，包括基因序列和基因间区域序列。在实际研究中，一个物种内的基因组差别不大，常说的是指物种的基因组，即参考基因组。
对于二倍体来说，两套染色体差异较小，常说的基因组是指单倍体的基因组，再加上差异较大的性染色体。
2. 转录组的研究对象
主要研究 mRNA ，但是生物体内 mRNA 只占一小部分（1%-5%） ，所以实验中应当提前去除其他RNA保留 mRNA。
mRNA 有编码蛋白质的能力，它又被称为编码 RNA 。而其他没有编码蛋白质能力的 RNA 则被称为非编码 RNA（ncRNA）。它们经由催化生化反应，或透过调控或参与基因表达过程发挥相应的生理功能。比如:
tRNA（转运RNA）在翻译过程中起转运RNA的作用
rRNA（核糖体RNA）于翻译过程中起催化肽链形成的作用
sRNA（英语：small RNA）（小RNA）起到调控基因表达的作用,比如组成剪接体的 snRNA ，负责 rRNA 成型的 snoRNA ，以及参与RNAi作用 的 miRNA 与 siRNA 等，可调节基因表达。
3. 转录组研究前提
相同基因在不同组织中表达不同
相同基因在同一组织中不同条件和时间中表达不同
因此，研究的转录组是指，某组织/细胞在特定条件下基因的转录情况。
4. 转录组测序流程理解
贴一个知乎专栏回答
https://zhuanlan.zhihu.com/p/139773946
5. 如何评价自己的测序结果和分析结果？
比如：
- 10个生物学重复和3个生物学重复对于差异基因的表达有多大的提升？
- 哪个差异表达鉴定软件更加准确？
引入以下指标，准确率、召回率、PRC、F-measure
举例
这里精确率的计算方式，把正确的加起来除以总的，这里 A 捞上来的700条鲤鱼和 D没有捞上来的虾和鳖是正确的。（因为我们只想捞出来鱼不想要虾、鳖，没捞上来的鱼不应该，捞上来的虾鳖也不应该）
但是这样会有问题，如下
举例
如果只预测人都健康，那么这个精确率会很高，但是不符合实际。所以，需要引进更专业的数据。
这里会发现，准确率和召回率很难平衡，就像渔网网孔的大小一样，所以就又引入了一个指标，F-measure。
这里P代表准确率，R代表召回率
另外一组评价体系和指标，敏感度、特异度、ROC、AUC
将捕鱼那个换一下概念
然后根据真阳性率和假阳性率作图，线条偏左上方的最好，如果难以判断就计算线条右下方的面积（AUC），面积越大说明真阳越多，假阳越少结果就越准确。
6. 转录组分析整体流程
- 提取 smallRNA或者 mRNA(最常用来研究的RNA)
- 随机打断
- 逆转录成 cDNA
- 测序
5.比对
有参考基因组的转录组
比对到参考基因组上计算表达量
有参考基因组
无参考基因组的转录组
先整合测序结果，组装一个参考序列，再进行比对计算计算基因表达量
无参考基因组
有参考基因组的可以额外多做一些东西，如：
7. 转录组项目设置
- 取哪些样品？
根据自己的实验设计来取样。设置几个重复？
- 多少数据量？
可以看出重复越多，测序量越大结果会越好。
测序深度建议
8. 混池测序
在探究差异表达基因的时候不能混池测序，如果实在想混池，样本一定要多，80，100+，大量样本的混池，如果仅是对序列进行研究那么可以混池测序
9. Trinity 拼接原理
Inchworm Algorithm（将 reads 打断成 k-mer，通过 K-mer 算法构建线性序列）
使用这种方法拼出序列
同时为寻找可变剪切提供条件
Chrysalis（根据线性序列 k-1mer 的重叠关系进行组合，构建可变剪切的关系（德布鲁因图）一个图对应一个基因，不同的路径代表不同的剪接形式）
Butterfly（根据 reads 对各个路径的支持，选择最优路径，打印出最终的序列）
10. 比对到参考序列
比对软件选择
还有其他很多软件可以做
11. RPKM FPKM TPM
RNA-Seq 数据的定量之RPKM和FPKM
RNA-Seq 数据的定量基本假设以及TPM
所以需要标准化
推荐使用TPM
12. 样品间表达标准化
鉴定样品间基因的差异表达时，我们往往关心的是绝对表达量是否有差异，因此需要对组间的数据进一步标准化。如图：
此处显然由于 G5 基因表达过高，导致其他基因相对表达降低。
解决方法1：
内参基因（管家基因，看家基因）：不同组织、不同条件下表达恒定的基因。
但是，看家基因数量不多，对于无参考基因组的物种来说也不现实，比较依赖基因注释结果。所以不太提倡使用。
解决方法2 ：
假设大多数基因都是没有差异表达的
image.png
实际操作中，trinity里面有相应的 run_DE_analysis.pl 脚本可以使用
目前还有没 TPM 和 TMM 的结合
13. 利用假设检验进行差异表达基因的鉴定
一般使用 t 检验
可以参考之前写的关于FDR那些
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