总揽
陈魏学基因系列-单细胞RNAseq测序原理 视频 总结
- 该方法有两个特点：特殊的引物设计，采用MMLV作为逆转录酶
引物设计
引物的第一部分-通用序列：PCR扩增的引物识别序列
引物的第二部分
引物的第二部分
引物第三部分-定位结构：非T简并碱基V
引物第四部分-简并碱基N
- 引物设计的第二、三、四部分目的是：使引物正好结合到mRNA的3'端的polyA尾巴的连接处。保证逆转录的起始位置是mRNA的3'端序列终止位置。
逆转录酶
MMLV逆转录酶可在合成的新链末端加几个不依赖模版的碱基C
SMARTer II A引物的3'末端是3个非脱氧的碱基G
SMARTer II A引物的3'末端是3个非脱氧的碱基G
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SMARTer II A引物引导MMLV逆转录酶参与以刚合成的cDNA链为模版的第二条链的合成。
得到双链cDNA，两端接好人工设计的PCR引物序列
- 然后加入“常规PCR引物”，进行常规扩增
- 再 超声打断，建库，测序
此法亮点总结
- 使用定位引物，保证互补链的合成是从mRNA的3'最末端配对处开始；同时保证合成的链的下游连接上通用PCR序列；
- MMLV逆转录酶可在合成的新链末端加几个不依赖模版的碱基C，保证了只有那些多带了几个碱基C的合成的第一链才能进行被作为模版进行第二条链的合成，保证是双链全长cDNA;
- 保证PCR扩增效率的一致性，通过在3'和5'端使用统一的引物序列；
SMART测序效率
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