摘要：
rna结合蛋白SRSF3(也称为SRp20)在调控pre-mRNA剪接中起着关键作用。srsf3的合子敲除导致胚泡阶段的胚胎阻滞。然而，SRSF3也存在于卵母细胞中，提示它可能是一种重要的母系遗传因子。在这里，我们确定SRSF3作为小鼠卵母细胞中可变剪接和转座元件的必要调节因子，以维持转录组的完整性。通过三维延时共聚焦实时成像，我们发现srsf3在发育完全的生发小泡（GV）卵母细胞中有条件的缺失极大地削弱了生发小泡破裂(GVBD)的能力，从而进入减数分裂。通过结合单细胞RNA-seq和卵母细胞的空间阻断反义寡核苷酸和RNAse-H诱导gapmers的微操作，我们发现突变卵母细胞中GVBD的缺陷是由于异常的可变剪接和B2 SINE转座元件的去抑制。总之，我们的研究强调了如何通过rna结合蛋白SRSF3控制母体转录组的转录身份对受精卵母细胞的发育至关重要。
介绍：
受精能力强的卵母细胞的发育包括完成减数分裂、细胞质成熟事件(为受精和胚胎发生提供能力)以及通过保护免受反转录转座子激活等干扰因素的影响而维持基因组完整性1。这些重要的过程在很大程度上依赖于mRNA和蛋白质，它们在卵母细胞生长阶段(2、3)作为母体遗传因子合成并储存在卵母细胞中。具有完整生发囊泡(GV)的生长卵母细胞在其生长阶段结束时的前期I(称为完全生长的GV卵母细胞)被阻滞。在黄体生成素的诱导下，完全生长的GV卵母细胞会经历生发囊破裂(GVBD)并恢复减数分裂。减数分裂I开始于减数分裂纺锤体的组装，当卵母细胞挤出第一个极体时完成。当卵母细胞在减数分裂II中期(称为MII卵母细胞)被阻滞时，减数分裂成熟完成2。由于生长中的GV卵母细胞从转录活跃状态过渡到完全生长的GV和MII卵母细胞的转录不活跃状态4，因此有必要在保持卵母细胞转录组完整性的同时，产生足够的母体转录本库。
影响转录组复杂性的最重要因素之一是pre-mRNA可变剪接(AS)5,6。小鼠基因组中绝大多数蛋白质编码基因(89%集合版本82)发生AS。通过AS正确组合外显子可确保表达特定环境所需的基因同种型。 AS 可导致具有不同功能的替代蛋白质亚型的表达 7，而剪接控制的缺陷可导致功能丧失，在多能细胞、发育和疾病模型中观察到严重的表型8,9。 小鼠和人类MII卵母细胞中保守的阶段特异性转录变体的存在 10-13 表明剪接控制在母体转录组的调节和建立中起着核心作用。 然而，影响卵母细胞 AS 和转录组完整性调节的因素在很大程度上仍是未知的。
富丝氨酸/精氨酸(Serine/arginine-rich, SR)剪接因子3 (SRSF3或SRp20)是一种rna结合蛋白，属于一个高度保守的丝氨酸/精氨酸(Serine/arginine, SR)蛋白家族14。与SR蛋白家族的其他成员一样，SRSF3是AS的剪接因子和调节因子，但它也参与许多其他转录后过程，包括RNA聚腺苷化21,RNA输出22,pre-miRNA加工23，以及内部核糖体进入位点介导的病毒RNA24翻译。SRSF3对着床前胚胎发育至关重要25，然而，其对母体转录组的贡献尚未见报道。在这里，我们发现小鼠卵母细胞中SRSF3功能的丧失严重损害了母体转录组，极大地损害了进入减数分裂的能力。通过分析SRsF3突变体完全生长的GV卵母细胞的单细胞RNA-Seq数据，我们确定了普遍剪接畸变，这部分解释了观察到的表型。令人惊讶的是，SRSF3缺失还引起了转录组组成的剧烈变化，其特征是突变卵母细胞中B2(SINE)逆转录转座子的表达增加。我们的研究强调了通过rna结合蛋白对母体转录组的精确控制对受精卵细胞的生长和发育是多么重要。
结果：
母系SRSF3蛋白的缺失导致发育在一个/两个细胞阶段停滞
尽管Srsf3合子敲除胚胎在囊胚阶段之前死亡，但卵母细胞衍生的 SRSF3 在卵母细胞中的作用尚不清楚。我们首先使用免疫荧光（IF）和单细胞定量 PCR 评估了 SRSF3蛋白和 mRNA 是否存在于卵母细胞和植入前胚胎中（图 1a，b）。我们的结果表明 Srsf3 在 GV 和 MII 卵母细胞中高表达（在减数分裂 II 的中期），因此它是一种母体因素。因为SRSF3存在于卵母细胞中，传统的合子敲除(Srsf3-/-)胚胎将在早期胚胎发生期间具有这种母系遗传的蛋白质。因此，我们使用Zp3-Cre交配策略建立了母体 Srsf3 敲除卵母细胞（称为 Zp3-Cre+，S r s f 3f/f），这导致所有雌性配子的功能丧失（补充图 S1a）26。 IF分析证实突变卵母细胞中不存在 SRSF3（补充图 S1b）。五只母体敲除雌性与野生型雄性交配，但没有一个产生活后代（数据未显示）。
为了确定不孕的可能原因，我们检查了从与野生型雄性交配的突变体Zp3-Cre+、Srsf3f/雌性中收集的母体敲除胚胎的发育（补充图 S1c）。 从五个有栓子的交配Zp3-Cre+、Srsf3f/雌性小鼠中，我们只从一只小鼠身上获得了受精胚胎。 此外，在体外培养过程中，突变胚胎在单细胞或双细胞阶段停滞（补充图S1d），并且根据 IF 判断，它们都缺乏 SRSF3 蛋白（补充图 S1e）。 总之，这些结果表明母体 SRSF3 对于植入前胚胎发育至关重要。
srsf3敲除的卵母细胞表现出严重的GVBD缺陷
为了确定母细胞敲除胚胎在卵母细胞中SRSF3耗尽后早期停止的原因，我们进行了3D慢速共聚焦实时成像，并在体外减数分裂成熟过程中用EB3-eGFP和H2B-RFP显示微管和DNA。为了控制完全生长的GV卵母细胞，我们发现GVBD之后，纺锤体组装转移到卵母细胞表面，一组染色体分离到第一极体。随后，第二个纺锤体组装，卵子在中期II期(称为MII卵母细胞)被阻滞(Supplementary Movie S1, Fig.1c)。在突变卵母细胞中，我们观察到两种相互排斥的表型。第一个表型以GVBD缺失为特征(Supplementary Movie S2, Fig.1d)，我们在所有突变卵母细胞中检测到66.7% (16 / 24)GVBD (Fig.1e)。第二种表型见于 33.3% 的突变卵母细胞 (8/24)，表现为延迟的 GVBD 和减数分裂纺锤体最终崩溃(Supplementary Movie S3, fig 1c - e)。这两种表型似乎是由突变卵母细胞中GVBD的缺陷引起的。
GVBD的主要调节因子是成熟促进因子 (MPF)，这是一种由 CDK1 (CDC2) 和调节亚基细胞周期蛋白 B127 组成的复合物。为了研究在突变卵母细胞中观察到的GVBD缺陷是否与 MPF 活性的失调有关，我们使用 FRET 生物传感器进行了 Förster 共振能量转移 (FRET) 实验，检测细胞周期蛋白 B1-CDK1 激酶磷酸化，从而检测对照和突变完全生长的 GV 卵母细胞中的激酶 在体外成熟期间（图 1f）。在所有对照卵母细胞中，我们发现了类似的CyclinB1-CDK1活性模式，其中 CDK1 在 GVBD 之前不久被激活。 随后，CDK1 活性逐渐降低，然后在极体挤出时再次达到峰值（图 1h）。 相比之下，突变卵母细胞表现出可变波动的 CDK1 活性，并且在 GVBD 之前没有观察到 CDK1 的主要激活峰（图 1g）。这些结果表明，在突变卵母细胞中观察到的GVBD缺陷可能是由减数分裂进入的上游中断引起的，而不是由GVBD所涉及的事件引起的。
卵母细胞中SRSF3敲除导致AS发生许多变化
为了研究GVBD缺陷的分子机制，我们对对照和突变卵母细胞进行了单细胞rna测序。对照和突变样本与小鼠卵母细胞公开的RNA-Seq数据聚在一起，并与其他着入期胚胎分开29(图2a)。当我们比较突变体和对照表达谱时，我们发现它们形成两个不同的组（图2b）。 有趣的是，与对照卵母细胞相比，突变卵母细胞的基因表达谱显示出更高的变异，这可能反映了与对照卵母细胞中观察到的严格进展相比，突变卵母细胞表型的更高变异，即使没有明确的亚群可区分（图 2b）。我们发现3190个基因（1440 个下调基因和 1750 个上调基因）在突变体和对照之间的转录水平上显示出显着（超过 2 倍）的差异（补充表 S2）。 尽管如此，我们发现大多数减数分裂相关基因的转录水平没有显着变化，包括MPF基因 Cdk1、Ccnb(cyclin B1)27、促进因子 Cdc25b30、Marf11、Plk131、Plk432、Bub1b33、Emi134 和 Securin35，或抑制因子 Ppp33b、Gpp2c Wee237、Pkmyt138、Kdm1a39、Cdh1、Fzr140、41 和 Cdc14b42（图 2c）。
由于SRSF3是AS的重要调控因子，我们想知道SRSF3耗尽是否会导致剪接模式的改变。为了检测新的AS事件，我们统计了所有的分裂reads(映射到基因组中两个不同部分的reads，“候选剪接事件”)。然后我们计算每个可变剪切event读取计数的折叠变化。由于我们感兴趣的是相对于同一基因的所有其他连接使用的变化，我们分别计算了每个基因的差异剪接，从而纠正了基因表达的整体变化。我们的结果显示，与对照组相比，突变卵母细胞中未注释的剪接事件增多(突变卵母细胞中为51%，对照组为32%)(图3a)，这表明AS在srsf3突变卵母细胞中受到强烈影响，导致出现大量未在任何环境中描述的亚型。虽然这些以前未注释的事件中有些可能是真正的规范AS事件，但也可能有一个子集对应于“异常”事件，这些事件在任何野生类型上下文中都不会以高频率发生。这些事件可能改变基因亚型的编码序列，从而可能改变蛋白质功能，在某些情况下导致非功能性基因亚型(Supplementary Table S3)。该分析还证实了突变卵母细胞外显子跳过事件的富集(图3b)。我们共同发现SRSF3对于维持剪接完整性至关重要，最常见的是通过促进野生型小鼠卵母细胞的外显子包含。
为了直接阐明srsf3调节的剪接活性与RNA结合之间的关系，我们分析了已发表的胚胎癌细胞交联和免疫沉淀(CLIP)实验数据44。在对照和突变卵母细胞中，利用SRSF3调节的盒外显子上的SRSF3 CLIP结合数据集生成SRSF3调节的剪接map45。我们发现，与SRSF3沉默的外显子(蓝色痕迹)或不受SRSF3调控的控制跳过外显子(灰色痕迹)相比，SRSF3增强的替代外显子也被称为突变特异性跳过外显子(补充图S2，红色痕迹)中的SRSF3结合水平升高。在增强的外显子两侧的长内含子区段中，结合没有升高(补充图S2，红色痕迹)。SRSF3在其侧翼组成外显子、其直接内含子侧翼以及与SRSF3沉默的备选外显子相关的所有区域的结合也没有明显升高(补充图S2，蓝色痕迹)。这些结果表明，SRSF3直接与SRSF3增强的盒外显子结合，并促进了成熟转录本中外显子的包含。（这个图没看懂）
在srsf3敲除卵母细胞中brd8和pdlim7 as调控不当导致GVBD缺陷
作为研究个体错误调节的AS事件对 GVBD 表型的贡献的起点，我们有选择地验证了一些预测在对照和突变卵母细胞中受 SRSF3 调节的外显子跳跃事件，重点关注具有与GVBD表型相关的功能的基因：Brd8（溴结构域 8）、Pdlim7（PDZ 和 LIM 结构域 7）和 Npm2（核质蛋白 2）。 BRD8含有结合乙酰化赖氨酸的溴结构域，并参与组蛋白乙酰转移酶活性、染色质重塑和转录的调节，pdlim7基因合子敲除小鼠可导致出生后致死。 NPM2 被称为卵母细胞衍生因子，对核仁组织和早期胚胎发育至关重要。
我们对照和突变卵母细胞进行了RT-PCR，利用引物在这些基因跳过的外显子两侧(补充表S1)，并测定了外显子跳过的百分比。我们的结果证实了brd8的第11外显子的跳跃性增加(图。3c, d)，npm2的外显子2和3(补充图S3a, S3b)和从使用pdlim7外显子5到外显子6的互斥开关(补充图S3c, S3d)。brd8和pdlim7的AS事件均在Ensembl中注释，并保持相同的阅读框架，而Npm2的外显子跳跃事件在本研究中是新发现的，并预测通过帧移位导致无义介导的mRNA衰减(NMD)。综上所述，这些结果表明，SRSF3在促进外显子包含以确保功能蛋白正确剪接和翻译方面具有关键作用。
接下来，我们研究了人工诱导AS是否可以再现突变卵母细胞中的GVBD缺陷。我们设计了反义寡核苷酸(ASOs)50靶向假设的SRSF3结合位点44，诱导brd8外显子11、Pdlim7外显子5、npm2外显子2和外显子3的特异性跳跃事件(图4a，补充图S4a，补充表S1)。然后我们将这些 ASOs 显微注射并将 ASOs 混入小鼠野生型卵母细胞的细胞质和细胞核中，并对单次注射的卵母细胞进行 RT-PCR，引物位于跳过的外显子两侧（图 4b）。我们的结果表明，将ASO显微注射到小鼠野生型卵母细胞中将所有三个 AS 事件转换为在 Srsf3 突变卵母细胞中观察到的剪接模式（图 4b-d，补充图 S4b-c）。接下来，我们允许注射 ASO 的卵母细胞进入减数分裂，并通过微管蛋白、微管标记物和 DAPI 的免疫染色检查 ASO 诱导的外显子跳跃对 GVBD 的影响，以可视化染色体（图4e，f，补充图 S4d）。我们发现ASO介导的 Brd8 和 Pdlim7 AS的变化导致这些注射的野生型卵母细胞的 GVBD 部分失败（图4g）。相比之下，ASO介导的 Npm2 外显子跳跃几乎不影响GVBD（补充图 S4e）。这些结果表明SRSF3介导的Brd8和Pdlim7外显子包含对于维持小鼠卵母细胞减数分裂中适当的GVBD是必不可少的。
Srsf3敲除卵母细胞显示 B2 SINE 逆转录转座子的去抑制
接下来，我们调查了我们的观察结果，即与对照样本相比，突变卵母细胞中可分配到基因的RNA-Seq reads的数量更少，这表明转录组的总体组成发生了显著改变。令人惊讶的是，这种差异很大程度上可以解释为重复元素的上调(图5a)。特别的是，我们发现SINEs，一种高度重复的反转录转座子，被系统地上调(图5b)。SINE逆转录元件无处不在，位于从基因间区域到嵌入蛋白质编码基因的整个宿主基因组中 51, 52，但通常像在对照卵母细胞中一样被抑制以防止不良后果 51。SINE元件的显着上调表明逆转录转座子可能对 Srsf3 基因敲除小鼠中观察到的 GVBD 缺陷有贡献，因此我们进一步研究了这种 SINE 上调。
在所有的SINE家族中，来自B2_Mm1a、B2_Mm1t和B2_Mm2的元素在上调的元素集合中明显过多(p< 1e−16,Fig.5c)。使用唯一映射的读数，我们确定了数千个元素，这些元素在三个SINE家族中的每一个的突变卵母细胞中的表达增加（补充表S4，图 5d）。 与此类SINE元件重叠的基因在突变细胞中表现出更高的表达，但与 SINE 表达的上调相比，差异要小得多（补充图 S5a-c）。为了更好地理解生成的转录本，我们首先对齐表达的元素，然后将RNA-Seq读数映射到对齐的元素（图 5e）。 我们的分析没有显示显着的剪接模式，表明生成的 RNA 主要由转录的 SINE 元件组成（图 5e）。
为了检验表达的SINE元件是否与非表达元件有不同的特性，我们调查了它们在注释基因中的分布。我们观察到在B2_Mm1a和B2_Mm1t家族的内含子中富集突变特异性元件，在这三个家族的外显子中富集元件(图5f)。这种外显子富集在B2_Mm2家族中尤其强烈(图5f)。当我们研究与上调的SINE元件重叠的外显子时，我们发现它们在3 '端（最后一个外显子处）显著富集(Fig.5g, j)。此外，表达元件更多地位于与重叠基因相同的一条链上(Fig.5h-j)。通过单细胞定量PCR，我们证实了B2 SINE元件上调了srsf3敲除卵母细胞(补充图S5d)。B2 SINE元件在合子野生型16-C胚胎中也高表达，而在合子敲除的16-C胚胎中表达不受影响(补充图s5e)。这表明SRSF3在卵母细胞中具有特异性抑制SINE基因表达的作用。
为了研究SRSF3如何调节B2 SINE的表达，我们检测了小鼠ES细胞和生殖细胞中抑制不同类型逆转录转座子的表观遗传修饰物的表达53。这些修饰因子在调控DNA甲基化/去甲基化、组蛋白甲基化、miRNA生物发生或piRNA通路等方面发挥重要作用。虽然大多数逆转录转座子抑制子的转录水平没有显著差异，但我们发现，与对照组相比，突变卵母细胞Piwil1(也称为Piwi或Miwi)下调了2倍(补充图S5f, S5g)，提示SRSF3缺失时异常的piRNA通路活性可能导致B2 SINE上调。另一方面，利用在线工具(RBPmap) (http://rbpmap.technion.ac.il/)69)，我们在表达的B2 SINE元件中发现了几个潜在的SRSF3结合位点(补充图S5h)。此外，我们分析了已发表的胚胎癌细胞CLIP实验数据44，发现SRSF3确实可以直接与B2 SINE元件结合(Supplementary Figure S5i)，这表明SRSF3与B2 SINE rna直接结合的缺失也可能导致突变表型。综上所述，我们的分析确定了卵母细胞转录组对SRSF3缺失的响应发生了显著变化，特异性地诱导了一个子集的SINE反转录转座子的表达。
上调B2 SINE表达有助于srsf3敲除卵母细胞中GVBD的缺陷
为了检测B2 SINE上调是否与GVBD缺陷有关，我们研究了在突变卵母细胞中上调的B2 SINE表达是否可以挽救GVBD缺陷。反义“gapmer”寡核苷酸直接rna - h裂解靶rna被用于降低B2 SINE RNAs54的表达。因此，我们设计了4个gapmers针对上调B2 SINE共识序列的不同部分(Supplementary Table S1)。为了研究这些gapmers对B2 SINE rna表达的影响，我们将这些聚集的gapmers微注射到对照和突变体完全生长的GV卵母细胞中，并在体外培养24小时后使用单细胞定量PCR检测B2 SINE rna的表达(图6a)。与未注射gapmers的突变卵母细胞相比，注射gapmers的突变卵母细胞B2 SINE rna表达显著下调(图6b)。引人注目的是，我们发现注射了B2 SINE gapmers的突变卵母细胞经历了类似于对照卵母细胞的 GVBD，而对照卵母细胞注射了 B2 SINE gapmers（图 6c，d）。 这些结果表明，减少上调的 B2 SINE RNA 确实可以挽救突变卵母细胞中的 GVBD 缺陷。
在小鼠marf1缺失的卵母细胞中，逆转录转座子的上调与核双链断裂(DSBs)的增加和GVBD缺陷有关1。然而，我们发现对照卵母细胞和突变卵母细胞之间的dsb数量没有显著差异(Supplementary Figure S6a-b)，提示上调B2 SINE可能不会通过增加dsb而导致GVBD缺陷。为了研究在小鼠野生型卵母细胞中过表达B2 SINE rna是否直接导致GVBD缺陷，我们利用B2 SINE基因的一致序列体外转录合成了rna。然后我们将B2 rna微注射到野生型完全生长的GV卵母细胞中，并测量注射卵母细胞发生GVBD的百分比(图6e)。我们发现，与水注射的卵母细胞相比，注射B2 SINE rna的卵母细胞的GVBD百分比显著减少(减少40%)(图6f, g)。这些结果表明，在突变卵母细胞中，上调B2 SINE rna有助于挽救GVBD缺陷。我们的研究强调了对母体转录组完整性的精确控制对于促进卵母细胞减数分裂和早期胚胎发育是多么重要。
讨论
母细胞遗传因子对受精能力强的卵母细胞发育和胚胎发生至关重要。然而，目前还不清楚如何控制母体转录组的建立，以及关键的调节因子是什么。许多证据表明，替代的pre - mrna剪接和加工对母体转录组的形成有重要贡献10,12。在这里，我们报道了rna结合蛋白SRSF3是有助于母体转录组精确建立和调控的关键因素。SRSF3缺失最显著的可观察表型是GVBD的缺陷，导致srsf3母系敲除小鼠不育(图1)。对照卵母细胞和SRSF3敲除卵母细胞的单细胞RNA-Seq分析(图2)显示，SRSF3不仅通过其在AS调控中的预期作用塑造卵母细胞转录组(图3，补充图S6c)，而且在小鼠卵母细胞中抑制转座因子表达(图5，补充图S6c)。
SRSF3耗尽对AS的一个显著后果是，两个注释的盒外显子(如brd8和pdlim7)以及以前未被观察到被跳过的外显子(如Npm2)的跳过增加(图3)。此外，将我们的RNA-Seq数据与已发表的SRSF3 iCLIP数据44进行整合，发现SRSF3在这些外显子内的结合达到峰值(补充图S3e)，这与SRSF3作为剪接激活子的传统作用一致，剪接增强子与剪接增强子结合。最近研究表明，SRSF3与核m6A“reader”蛋白YTHDC155共同调节一些选择性剪接的外显子。在小鼠卵母细胞中，SRSF3是否参与了内标组和AS之间类似的功能交互仍是一个有趣的可能性。
依赖srsf3的AS事件包括可能与GVBD表型相关的基因内的外显子。值得注意的是，尽管许多AS事件都受到SRSF3缺失的影响，但我们能够部分复制GVBD缺陷，使用外显子靶向ASOs诱导pdlim7或brd8基因的单个剪接事件的改变(图4)。这些AS事件的选择是由于基因与GVBD的功能关联。然而，AS事件对蛋白质亚型功能的确切影响尚不清楚。brd8外显子11的跳跃性维持了阅读框，与mRNA序列从17外显子到19外显子编码的溴域距离较远。在pdlim7外显子5和6的选择之间切换也维持了阅读框，直接影响编码蛋白在PDZ结构域的c端和c端LIM结构域的上游。虽然外显子5编码插入的长度相当长(40个氨基酸比6个氨基酸)，但在srsf3敲除后诱导的外显子6亚型编码一个功能未知的PFAM结构域(DUF4749)56，该结构域可能调节PDZ结构域的肌动蛋白结合功能。相比之下，npm2外显子2和外显子3的跳过被清楚地预测会通过帧移导致NMD而导致功能丧失，但这一事件的操纵对GVBD没有影响(补充图S4)。
令人惊讶的是，卵母细胞中SRSF3的缺失也极大地改变了转录组的组成，B2 SINE逆转录转座子的表达显著且一致地激增(图5)。在人类细胞中，由于内含子Alu元素的“外显”，当hnRNPC被敲低时，表达的Alu序列被上调57。Alu元素含有类似于真性剪接位点的序列，但这些序列通常被hnRNPC阻断。相比之下，上调B2 SINES insrsf3敲除的卵母细胞是自主转录的(图5)。值得注意的是，在野生型卵母细胞中，B2 SINEs的实验过表达足以诱导GVBD的缺陷(图6e, f)，表明转录组的多种变化有助于观察到的srsf3敲除了卵母细胞的表型。与剪接相比，SRSF3 的直接作用很可能（图 4h），导致 B2 SINE 诱导和 GVBD 后续缺陷的机制不明显，但可能是由 SRSF3 的间接或直接作用引起的。 上调可能是由 PIWI 相互作用 RNA（piRNA）途径的成分下调引起的间接影响，例如 Piwil1（补充图 S5e，f），导致 B2 SINE 反转录转座子的沉默或降解丧失。 我们没有检测到 Piwil1 的剪接改变，这可能是通过 SRSF3 的直接剪接效应导致其下调的原因。 然而，这可能与我们的单细胞 RNA-Seq 数据中缺乏序列深度有关，特别是如果新的外显子跳跃事件导致 NMD。 在这种情况下，B2 SINE 上调将是破坏 SRSF3 作为剪接因子的常规功能的下游结果。
另一方面，也可能存在直接作用，因为B2 SINE共识序列包含预测的SRSF3结合位点，对已发表的SRSF3 CLIP数据的生物信息学分析表明，SRSF3与B2 SINE直接结合(Supplementary Figure S5G-I)。这种直接作用意味着SRSF3的结合导致B2 SINE rna的降解，这将是SRSF3的一种新功能。B2 SINE与SRSF3的结合也可能解释了注射B2 SINE RNA诱导GVBD表型的能力。由于SRSF3的可用水平较低，注射RNA对SRSF3的隔离可能导致靶AS事件的错误调控，这一过程类似于as RNA结合蛋白被CUG扩展RNA隔离所导致的剪接错误调控。
除了众所周知的剪接调节因子，SRSF3还在RNA聚腺苷化21、RNA输出22、pri-miRNA加工23和翻译中发挥转录特异性作用24。仍然有可能，这些过程中的一些调控不当也可能导致GVBD表型。然而，通过操纵SRSF3调控的单个AS事件来部分重现GVBD表型的能力与SRSF3的主要功能被破坏是一致的。
计算和实验的局限性给确定卵母细胞的分子机制带来了挑战，因为可能的实验分析仅限于那些为单个细胞开发的。计算上，研究B2元素的主要挑战之一是其短而高重复的DNA序列。尽管可以识别出大量的活性位点，但它们并不总能被区分出来，因此，相对于基因表达的估计，单个元件的表达估计更不确定。我们的分析表明，相对于现有基因而言，表达的B2 SINE元件与未表达的元件是不同的(图5)，然而，高度的不确定性使得对周围基因表达的任何关联产生准确的生物信息学预测具有挑战性。虽然通过内源性小干扰RNA或piRNAs52抑制反转录转座子的研究为DNA甲基化、组蛋白修饰和序列特异性RNA降解的作用提供了一些见解，但关于这种强烈诱导B2 SINE在卵母细胞表达的研究实例尚不清楚。尽管其机制尚不清楚，但我们的发现为通过上下文特异性RNA结合蛋白调控逆转录转座子开启了令人兴奋的新可能性。
综上所述，我们报道了在敲除srsf3后，小鼠卵母细胞的转录组组成出现了高度可重复、普遍的变化，以及数百个剪接异构体的失调。我们的研究强调了AS和逆转录转座子表达在维持细胞功能中的相关性，并提示SRSF3在小鼠卵母细胞转录完整性的建立和控制中发挥了重要作用。
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