摘要：
选择性剪接(AS)在哺乳动物基因组中普遍存在，但跨物种比较主要局限于成体组织，大多数AS事件的功能仍不清楚。研究人员评估了六种哺乳动物和一只鸟类的七个器官产前和产后发育中的AS模式。分析表明，发育动态AS事件,特别是在大脑中普遍存在，实质上比非动态更加保守。在发育过程中，包含频率增加的盒式外显子显示出最强的保守和调控AS信号。新近出现的盒式外显子通常在睾丸发育的后期被整合，但在进化过程中保留的外显子主要是大脑特异性的。本研究表明，控制基因表达水平和选择性剪切的程序之间复杂相互作用是器官发育的基础，特别是对大脑和心脏。在这些调控网络中，选择性剪切通过从广泛表达的基因中产生组织特异性和时间特异性的亚型，提供了基因的大量功能多样化。
前言：
选择性剪接是在前信使RNA中不同地选择剪接位点以产生不同的RNA和蛋白质异构体的过程1。选择性剪接在哺乳动物中普遍存在，影响大多数多外显子基因，并解释了巨大的异构体多样性。许多可供选择的剪接网络和功能的调节方面已经被发现。然而，大多数可供选择的异构体的功能相关性仍不清楚2。基因组规模的研究报告说，只有一小部分选择性剪接事件表现出进化上的保守性或具有其他广泛的功能支持3-10。因此，有人认为，选择性剪接产生的大部分异构体多样性代表转录噪声4,6-10，尽管这种解释一直有激烈的争论8,9,11,12。
跨物种比较为全面评估选择性剪接的功能、调控机制和进化动力学提供了一个强大的框架；例如，他们揭示了选择性剪接事件在进化过程中的总体快速更替，并确定了祖先哺乳动物的剪接调控因子和相关的结合基序5，13。然而，这项工作仅限于成体组织(除外2，14-17)，尽管选择性剪接可能在器官发育过程中发挥关键作用2，17。
为了填补这一关键空白，我们基于广泛的RNA测序(RNA-seq)数据集18，生成了七个物种的七个器官的发育选择性剪接图谱(https://apps.kaessmannlab.org/alternative-splicing)。对这些图谱的综合比较分析揭示了哺乳动物器官发育过程中选择性剪接的进化动力学和功能相关性。
发育选择性剪接图谱。为了研究发育选择性剪接的进化，我们利用了一个包含1890个文库的RNA-seq数据集，该数据库涵盖了从早期器官发生(心脏的器官中期发生)到成年的7个器官(前脑/大脑、后脑/小脑、心脏、肾脏、肝脏、卵巢和睾丸)的发育，涉及6种哺乳动物(人、猕猴、小鼠、大鼠、兔子和负鼠)和一只鸟(鸡)18只(图1a；我们对所有物种的转录区域进行了详细的从头注释，包括剪接位点的精确定位(补充数据1-7)。这种从头注释防止了由于物种之间的基因组注释质量差异而在下游分析中产生的偏差，并检测到新的剪接变体15、19、20(补充图1和方法)。我们将基因片段定义为两个相邻剪接位点之间的序列(补充图2)。可选片段(即并不包括在所有转录本亚型中的片段)被分为四个主要的可供选择剪接类别：可供选择的盒外显子、可供选择的供体片段、可供选择的受体片段和内含子保留事件(图1b)。使用已建立的程序15、19、20(方法)测定每个备选片段和物种间1：1同源外显子的包涵体频率(剪接百分比(PSI))(补充数据8)。
我们从七个物种中确定了数千个主要编码可供选择的剪接事件，用于七个物种的每个器官中的四个类别(图1b，补充表1和方法)。正如之前观察到的那样，盒式磁带外显子和内含子保留是最常见的两类。在每个类别和物种内，检测到的AS事件的数量在各组织21之间是可比的(图1b和补充图3)。相比之下，在包涵体频率随时间发生显著变化的AS事件中(称为“发育动态选择性剪接”(DevAS)方法)，脑组织和睾丸脱颖而出，其DevAS事件的数量和比例比其他器官要大得多(图1c，补充图3和补充数据9)。在性成熟过程中，睾丸的细胞成分发生了根本性的变化，生精细胞成为主要的22、23细胞。这些细胞类型都有广泛的开放染色质，可以促进各种类型的转录噪音，包括选择性剪接23-26。我们一致地证明，性成熟的睾丸驱使睾丸中所有类别的DevAS水平都很高(图1c)；也就是说，当考虑到性成熟之前的发育阶段时，睾丸中过量的DevAS就消失了(扩展数据图2)。因此，睾丸的DevAS信号可能反映了细胞成分，而不是发育中的选择性剪接程序开关。相比之下，当分析局限于性成熟前阶段时，大脑中过多的DevAS事件仍然存在。因此，大脑中明显的DevAS信号可能反映了选择性剪接对该器官发育的特殊重要性。
我们利用亚抽样分析研究了不同物种发育采样的差异如何解释检测到的选择性剪接和DevAS事件数量的差异(图1b，c和补充图3)。这些分析表明，当采样方案匹配时，猕猴中的选择性剪接和DevAS事件的数量，我们缺乏早期产前数据(扩展数据图1)，变得与人类相似(补充图3)。总之，我们的子抽样分析表明，物种之间的主要差异是在灵长类动物中检测到的选择性剪接事件的数量多于其他物种(补充图3)，这与成年后的选择性剪接分析一致。然而，灵长类中DevAS事件的数量并不多这一事实表明，灵长类中检测到的选择性剪接事件的过量反映了灵长类中近中性(轻度有害)的转录噪声，这与它们较低的有效种群数量(即较弱的净化选择)24，27有关。
考虑到大量的DevAS盒式外显子，以及之前对这种选择性剪接种类3、5、17、21的强烈关注，我们将所有后续的分析都集中在盒式外显子上。
选择性剪接在大脑和心脏发育中扮演着不成比例的角色。为了探索样本之间的全球选择性剪接关系，我们在每个物种(方法)中进行了多维缩放(MDS)分析。样本按器官聚集，对于心脏，特别是脑组织，样本按发育阶段排序(图1d和补充图4)。这种聚类表明，在发育过程中，特别是在大脑和心脏的发育过程中，不同的剪接程序会不断分化。事实上，基于PSI相关性对发育选择性剪接状态与最早胚胎阶段的比较表明，在发育过程中备选剪接模式有逐渐的分化，但大脑的比率要高得多(图1e和补充图4)。这与基因表达水平形成对比，在基因表达水平中，大脑不是异常值(图1e和补充图4)。睾丸中选择性剪接对性成熟的相关性突然下降也可见于基因表达水平，这可能是由于具有广泛转录噪声23-26的主要生精细胞群体的出现(见上一节)。因此，这种下降并不代表功能性选择性剪接程序的切换，而是反映了由于细胞组成的根本变化，性成熟前后的选择性剪接模式之间缺乏联系。再加上脑组织中DevAS事件的较大比例(图1c)，这些分析表明，替代剪接程序在大脑发育中扮演着不成比例的角色，在较小的程度上，心脏发育也是如此。然而，心脏的DevAS模式不那么明显，可能是因为在我们最早的采样阶段，心脏比大脑(和其他器官)更发达。
然后我们研究了DevAS的器官特异性。我们发现，大多数DevAS事件(64-84%取决于物种)是特定于一个器官的，这与成年后的观察一致12。值得注意的是，在多个器官中有DevAS的盒式磁带外显子中，特定的器官对比其他器官更频繁地被观察到。选择性剪接预计，前脑/大脑和后脑/小脑是最常见的配对(P<10−34，优势比(OR)=2.1-6.7，Fisher‘s精确检验)，但令人惊讶的是，肾和肝脏对也过多(P<10−2 9，OR=3.0-7.7，Fisher’s精确检验；扩展数据图3)。这些结果表明，选择性剪接程序的调控在器官之间是共享的，并可能是协调的。值得注意的是，大多数DevAS事件(以及一般的选择性剪接事件)发生在具有广泛空间表达谱的基因中(图1f)，这一结果在具有不同外显子数量的基因之间是一致的(补充图5)。例如，人脑中75%的DevAS事件发生在具有广泛空间表达的基因中(组织特异性<0.5；图1f)。这些结果表明，DevAS可能允许在无处不在的表达基因中实现器官特异性发育功能。
高度保守的动态发育选择性剪接。接下来，我们描述了器官间选择性剪接的进化保守性。我们发现，大多数(∼65-81%)在所有物种中交替剪接的1：1的同源盒式外显子在所有物种中至少在一个器官中显示DevAS，几乎所有(97%)在至少一个物种中都显示DevAS。相比之下，在每个物种中交替剪接的外显子中，只有~31-38%的在至少一个器官中显示出DevAS。对1,441个同源盒式磁带外显子的
MDS分析(图2a)反映了物种特异性的MDS分析(图1和补充图4)。样本按器官聚集，对于心脏和脑组织，样本按发育阶段排序(图2a)。器官主导的聚集性表明器官保存了DevAS信号。对盒式磁带外显子两侧的内含子序列(即潜在包含选择性剪接顺式调控序列28的序列)的分析进一步支持了DevAS的强保守性，这表明DevAS的保守性比非DevAS事件高得多(图2b；所有器官的P<10−10，Mann-Whitney U检验)，这与小鼠皮质发育的结果一致。大脑中高度保守的DevAS事件的例子是DLG3的三个盒式外显子，它编码一种与学习障碍有关的突触相关蛋白29，30(图2c)。
DevAS的保守性表明，DevAS的谱系丰富了主动调节的功能选择性剪接事件。事实上，我们发现在DevAS事件中保存阅读框架的外显子的比例比非DevAS事件高得多(图2d；对于所有器官，P<10−10，比例测试)，这与小鼠皮层发育的工作一致16。此外，与其他选择性剪接外显子相比，DevAS外显子显著丰富了蛋白质内在无序区域的编码潜力,即蛋白质相互作用网络的潜在调节因子31(图2e；除肝脏外，所有器官的P<0.005，比例检验)。
早期发展与后期发展的对比。蛋白质编码基因的表达水平在最早发育阶段的各个器官中最为相似，然后逐渐分化成不同的发育程序18。我们发现，随着发育的推进，选择性剪接程序通过在器官之间逐渐分化，特别是对大脑(图3a和补充图6)，平行于这种表达模式的时间多样化。睾丸中的不同剪接模式显示出在性成熟方面
与其他器官的差异急剧增加，这与我们之前的观察(图1e，扩展数据图2和补充图4)和报告的基因表达水平的模式18是一致的。我们的分析还表明，在发育早期主要表达的基因显示出比后期表达的基因更低的DevAS比率，特别是在大脑和睾丸中(图3b)。这些观察结果表明，DevAS在器官分化过程中起着重要作用。
我们进一步发现，在进化过程中，早期的Devas事件比晚期的Devas事件保存得更完好(图3c和补充图7)。这与编码和非编码基因表达18、32的差异模式是一致的。因此，尽管在发育早期使用的基因中DEVA的比率较低(图3b)，但在这段时间内，DevAS受到了更强的选择性限制，理由是它在早期器官发生中的重要性。
基因表达水平的变化率在发育过程中并不是恒定的。一个主要的变化期与早期发育中器官特性的建立有关，另一个主要变化期与向成熟的特定器官功能的过渡有关18，32。我们发现，在所有物种的发育过程中，DevAS的PSI变化率和连续阶段之间的基因表达水平高度相关(图3d和补充图8)。这种相关性意味着在发育过程中基因表达变化较大的时期(特别是所描述的两个时期)也表现出较大的DevAS变化。然而，我们发现，这主要是通过不同的一组基因发生的。在发育变化的两个主要时期，只有~10%(范围：0-55%)的有显著变化的基因也表现出显著的基因表达变化。尽管有这种有限的重叠，我们仍然偶然地观察到两种机制改变的基因比预期的要多(在105个比较中，有30个用Fisher‘s Exact test Benjamini-Hochberg调整P<0.05；补充表2)。总体而言，我们的分析表明，总体上，尤其是关键的个体发育期的发育是由控制基因表达水平和选择性剪接的程序相互作用形成的。
外显子在发育过程中的使用。为了研究DevAS的时间模式，我们将每个器官的外显子分为四种主要模式(图4a，扩展数据图4以及补充图9和10)：在发育过程中包涵体频率逐渐增加(称为‘UP’)，包涵体频率逐渐降低(‘DOWN’)，先增加后减少(‘UP-DOWN’)，以及先减少再增加(‘DOWN-UP’)。值得注意的是，在物种之间，大多数DevAS外显子(59-95%)呈现上升或下降模式(分别为23-58%和24-58%；图4A，扩展数据图4和补充图10)。当在整个开发过程中强制定期采样时，我们获得了类似的结果(扩展数据图4)。总体而言，UP模式倾向于在器官和物种中最普遍，这与之前对小鼠皮层16和心脏14发育的研究一致(图4a和扩展数据图4)。此外，80%的病例在两个器官出现上下模式时，时间变化的方向是相同的。这种一致性支持发育的AS调节在器官之间协调(与器官对的过度表达一致；扩展数据图3)，并涉及共同的调节因子(下图)。
这些特定的时间模式导致器官之间选择性剪接的主要发育差异(图4a和补充图10)；也就是说，特定器官中盒式磁带外显子的上下模式通常伴随着这些外显子在其他器官中的低且非发育动态包含率。相反，向下和向下-向上模式通常伴随着其余器官中这些外显子的整体高/稳定和非动态包含率。这些时空模式可能与早期的选择性剪接程序有关，这些程序在器官之间非常相似，然后在发育过程中逐渐分化(图3a)。
UP或DOWN盒式外显子侧翼内含子的序列保守性和保框外
显子的比例显著高于UP或DOWN盒式外显子(图4b-d)。这些观察表明，发育内含物的增加比减少具有更大的功能相关性，这可能更多地对应于另一种剪接噪音。我们始终在外显子两侧的内含子序列中检测到富集的内含子剪接调控元件(ISRE)基序和其他六聚体序列(即潜在的内含子剪接调控元件)数量显著高于外显子下方的内含子序列(P<10−96，二项式检验；图4e，f)，这一结果对外显子下采样具有很强的鲁棒性(补充图11和方法)。这进一步支持了包裹体的渐进性增加，构成了一种比包含物减少更规范和更具功能相关性的DevAS形式。然而，这两种类型的高度保守的实例都存在(图2c：外显子2是一种保守的向上情况，外显子1和3是向下的外显子)。在大脑和心脏中发现了强大的UP模式，进一步支持了DevAS在这些器官中的重要作用。在睾丸中也发现了它们，这可能表明性未成熟睾丸向成熟睾丸的转变伴随着新生生精细胞类型和/或体细胞支持细胞中外显子的至少部分调节的PSI改变。
剪接因子(SFS)可以对外显子的使用产生相反的影响，这取决于它们是结合到它们的基序上-还是在备选外显子28的下游。为了寻找这样的基序，我们检查了具有向上或向下模式的DevAS事件的六聚体序列频率。对于大脑和心脏，我们偶然检测到位于上外显子上游和下外显子下游的过度表达的六角体序列的数量比预期的要多得多(P<10−10，费舍尔精确检验；补充图12)。这些对比的基序定位表明，相应的SFS在发育过程中促进或抑制外显子包含，这取决于六角体基序的内含子位置及其发育活动动态，导致观察到的向上和向下的发育包含模式。
我们发现了一个值得注意的案例，即ISRE基序在器官之间存在潜在的相反极性效应。一个类似于AS调节因子的六聚体基序(ACTAAC)，颤抖同系物，KH结构域RNA结合(QKI)，在发育中的大脑和心脏33，34中具有关键功能，在大脑的上外显子上游和下外显子下游富含，而在心脏中，它显示出相反的模式(图4G和补充图13)。当结合在盒外显子35的上游时，QKI起到抑制子的作用，当结合到盒外显子35的下游时，QKI起到激活剂的作用。我们的观察表明，QKI靶向外显子的发育动力学不仅取决于QKI结合基序的定位，还取决于其跨调控环境的器官特异性发育动力学，即QKI和/或它可能与之相互作用的一个或几个SFs的发育表达/活动模式(图4g，右图)。
我们的结果表明，在大脑中，QKI和/或潜在的协同调节因子的活性随着时间的推移而降低，导致具有上游QKI基序的外显子的包含子频率增加(向上模式)，这是因为QKI/协同调节因子对包涵体的抑制作用逐渐减弱。带有下游QKI基序的外显子表现出相反的行为。相反，在心脏，QKI/协同调节活性可能随着时间的推移而增加，导致上游QKI基序的外显子的包含率降低(向下模式)，因为QKI/协同调节因子对包含性的抑制逐渐增强。带有下游QKI基序的外显子显示出相反的模式。
微外显子。微外显子是一类特殊的非常短(3-27nt)且主要是框架保存盒外显子36、37。我们发现，与其他器官相比，大脑中DEAS的微外显子过多，从而扩大了对成人大脑37的观察(图5a，b和补充图14)。这种过剩明显大于较长的盒式磁带外显子(称为“大外显子”)(图5B和补充图14)。然而，当将分析限制在数量多得多的大外显子(补充图15)时，大脑中DevAS的总体过剩及其特定模式(图1c和2a)仍然非常相似。虽然不那么明显，但涉及微外显子的DEAS事件过量也发生在大多数其他器官中(图5b和补充图14)。微外显子中DEAS的富集是由微外显子驱动的，在发育过程中PSI逐渐增加(向上模式)(图5C和补充图14)。然而，对于大脑中的大多数UP微外显子，PSI的大部分增加发生在出生前(图5d)。UP大外显子在大脑中显示的产前变化比例明显小于UP微外显子(图5d；所有物种的P<10−4，费舍尔精确检验)。总体而言，我们的观察显示，微外显子的包含率在发育过程中增加，这表明微外显子在早期大脑发育中起着突出的作用。后一种观点与微外显子是神经元特异性的，主要参与神经发生37，38，以及与自闭症相关的微外显子调控失调是一致的，自闭症37是一种与大脑发育早期主要表达的基因相关的紊乱。
以往的研究表明，微外显子比大外显子37、38更保守，功能更相关。聚焦于Devas外显子，我们发现确实，微外显子在其内含
子侧翼显示出比大外显子更高的序列保守性(图5e)。此外，与Devas大外显子相比，含有Devas的微外显子的比例更大(~90%)，从而保持了阅读框架(图5f)。脑、心脏和肝/肾中具有高度保守的DevAS模式的微外显子的例子分别存在于基因GDPD5、TMED2和PAPSS2中(扩展数据图5-7)。总之，我们的发现表明，微外显子构成了一类高度选择性地保存的可供选择的外显子，在早期发育，特别是大脑的发育中起着重要作用。
新的外显子诞生和外显子交替。在成人组织中，新的外显子通常在进化过程中以选择性剪接盒外显子5，41，42的形式出现。因此，我们在器官发育的背景下评估了新的(内部)盒式磁带外显子的起源和进化(图6a，补充数据10和方法)。我们发现，新的替代外显子(即在真核生物进化过程中出现的外显子)在发育后期比早期使用得更频繁(图6b)。这种发展模式也可以在其他分子创新中观察到，这可能是由于在促进分子创新的发展过程中，功能约束逐渐减少所致。我们发现，就像在成人睾丸43中观察到的那样，非常年轻的盒式磁带外显子(即物种特有的)主要合并到睾丸异构体中，而年龄较大的新外显子(即出现在真兽类的祖先中)主要用于大脑(图6c)。值得注意的是，年龄越大的新外显子也显示出更高比例的DEAS、平均PSI、帧保存和编码潜力(图6d-g)。总体而言，我们的发现与对全新基因的出现和“睾丸外”情况的观察结果相一致42，44。我们认为，新的哺乳动物外显子的初始转录/剪接是由性成熟睾丸23、24中生殖细胞的允许转录环境促进的。虽然这些新的外显子中有许多仍然没有功能，并最终消失了，但有一个子集在睾丸中进化了功能角色。在更长的进化期内，这些新外显子中的进一步突变被固定，导致它们包含在其他器官中，并在其他器官中发挥功能，特别是大脑。
我们发现，40-50%的物种特异性新外显子与转座元件(TES)重叠，特别是短穿插核元件和长穿插核元件，这与以前的工作43，45是一致的。我们还发现，随着外显子进化年龄的增加，新外显子与TES强烈重叠的百分比逐渐下降(扩展数据图8)。我们的观察表明，与来自独特序列的外显子相反，TE衍生的外显子大多没有被选择性地保留很长的进化期。然而，也有可能TE衍生的外显子的序列特征在更长的进化过程中发生了无法辨认的变化。基因APP中有一个新出现的替代外显子的例子，它起源于真兽类的共同祖先(图6a和扩展数据图9)。这个外显子的无义突变，主要包括在早期大脑发育中(扩展数据图9)，导致人类大脑发育的严重损害46。我们还研究了新的可供选择的外显子的另一个进化来源：构成外显子。
在我们称之为“交替作用”(图6a和补充数据11)的过程中，组成性外显子在固定影响剪接的突变后进化为盒外显子47。交替的外显子显示出与新外显子的几个相似之处：从睾丸偏向于脑的包涵体(图6h)，以及随着进化年龄的增加(与成人组织中的工作一致)，DEAS(图6d)和框架保存外显子(图6f)的比例增加。然而，与交替外显子起源于功能构成外显子的事实一致，并且与新的外显子相反，几乎所有的外显子都有编码能力(图6g)，并且随着进化年龄的增加，平均PSI下降(图6e)。这些观察表明，较早的交替事件的更多实质性和发育动态的跳过可能具有功能相关性，而不频繁地排除年轻的(通常是扰乱帧的)外显子可能主要反映了转录噪声。选择性剪接举个例子，AMPD2基因中的一个外显子只在灵长类动物中有选择性(图6a和扩展数据图10)。这个外显子的缺失，在发育过程中逐渐排除，特别是在大脑中(扩展数据图10)，与神经退行性运动神经元疾病48有关。
讨论
我们对7个物种的发育选择性剪接图谱的比较分析表明，在进化过程中，DevAS比更频繁的非动态选择性剪接保存得更完整。DEVAS还显示了多个功能，这些功能表明它总体上高度丰富了功能性的选择性剪接事件，正如之前所建议的16。然而，不同器官、不同发育时期、不同外显子使用模式、不同外显子年龄和不同类型的盒外显子，DevAS的程度和选择模式不同。我们的工作为脊椎动物器官和物种间选择性剪接的发育模式提供了一个全球视角。然而，它有一个重要限制，即块状组织RNA-SEQ数据通常不允许评估细胞成分变化的相对贡献。
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