单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够表征来自复杂组织的单个细胞之间的基因表达差异，提供更高分辨率的转录组信息。目前大多数单细胞实验都是使用短读长完成的。由于短读长的片段化，只能捕获分子的各端。测序片段只能在基因水平上提供表达信息，缺少可能对疾病或生物功能十分关键的异构体多样性分析。
而单细胞全长转录组测序，可获得完整mRNA序列，用于对不同mRNA异构体、可变剪切、融合基因等进行分析，随着单细胞研究领域的越来越深入，在癌症、神经生物学、发育生物学、免疫学、基因编辑、耐药研究等方向都有广泛应用前景。
二代单细胞转录组（左）与单细胞全长转录组（右）的差异
Oxford Nanopore单细胞全长工作流程
起始样本制备与细胞捕获流程与10x Genomics流程一致，通过反转录后生成带有barcode的全长cDNA，作为建库流程的input。使用生物素化引物对带有barcode的cDNA样本进行PCR扩增，然后采用链霉亲和素下拉法，去除缺乏细胞barcode的截短cDNA分子，这样可以使全长cDNA的测序效率最大化。然后使用Oxford Nanopore的cDNA-PCR测序试剂盒制备测序文库。最后使用Oxford Nanopore PromethION平台进行测序。
数据下机后可使用Oxford Nanopore的wf-single-cell分析流程，对测序设备生成的原始纳米孔读长序列的输入文件(FASTQ)进行过滤和分析，并输出基因和异构体计数矩阵、UMAP细胞簇图等分析结果。
Oxford Nanopore单细胞工作流程
Oxford Nanopore单细胞全长实测数据分享
通过对Oxford Nanopore的单细胞全长转录组工作流程进行测试，得到了十分出色的结果数据。
小鼠样本Oxford Nanopore测序数据质量（上）与基因分群（下左）、转录本分群（下右）结果
通过对Oxford Nanopore测序数据与Illumina测序数据的一致性分析，发现二者的细胞分群结果呈现较高的一致性，且UMI与基因检出数相关性较高（R≥0.99）。
Oxford Nanopore单细胞测序结果（数据量1个cell）与Illumina测序结果（100G）细胞分群（上）与UMI检出数（下左）、基因检出数（下右）一致性对比
综上所述，Oxford Nanopore单细胞工作流程可实现单细胞转录本水平的异构体检出、可变剪切、融合基因等分析内容，同时结合Illumina测序数据可实现准确的基因和转录本定量，精准定位表达差异。在二代单细胞转录组的基础上更深入挖掘细胞间异质性，开启单细胞应用的新视界！
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