[2018-11-05读完]《核酸探针与原位杂交技术》读书摘录
《核酸探针与原位杂交技术》向正华+刘厚奇.第二军医大学出版社.2001
标记物包括：地高辛、生物素、荧光素、酶类、核素等。（前言p1）
嘌呤碱和嘧啶碱一般都不易溶于水，对250～280nm波长的紫外光有较强的吸收，对260nm光波的吸收能力最大。（p1）
维持DNA双螺旋结构的力量有：①氢键，②碱基堆积力，③离子键。（p4）
碱基堆积力（base stacking force）：碱基在螺旋中都以相同的平面叠在一起，层层堆积，它们之间存在着范德华力，另外碱基都是疏水性的，在双螺旋内部形成一个疏水核心，因此又有疏水的力量综合在一起，就形成碱基堆积力。（p4）
DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生，增色效应是爆发式的。（p6）
Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关，例如pH、离子强度和DNA的碱基比例。（p6）
(G+C)%=(Tm-63.0)×2.44（p8）
DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/L NaCl溶液中较稳定。（p8）
如将热变性的DNA分子快速冷却到低温，则大部分DNA不能复性。（p8）
一般DNA复性在60℃，但如果溶液中含50%甲酰胺，则最佳温度在42℃。（p9）
环状DNA（即使是带切口的环状DNA）的转化效率比线性DNA高得多。（p17）
核酸分子杂交技术的发展：平衡密度梯度离心法→DNA-琼脂技术→硝酸纤维膜→尼龙膜（p26-28）
生物素标记存在内源性生素的处理问题，而地高辛是从洋地黄植物中提取出来的，在动物体内不存在这类分子，因此不存在生物数量的本底问题。（p31）
理论上原位PCR的敏感性是ISHH的10～100倍，可检测到1个拷贝的核酸分子。目前原位PCR的重复性和特异性都不尽人意，有待进一步改善。（p31,33）
钙转化缓冲液：10 mM Tris-HCl pH8.0, 50 mM CaCl2（p36）
抽质粒加入Sol II后不能用混旋器混匀，防止细菌染色体断裂。观察管内物的粘度，如拉丝很长，说明质粒很多。（p38）
一般酶切完全的样本（单一酶切位点）只出现一条DNA带即线性DNA载体。酶切完全时的酶切条带应该比对照样本的两条带都要走得慢。（p44）
常用的放射性同位素标记：32P、35S、3H。（p49）
标记探针分为均一标记探针（uniformly-labeled probe）和末端标记探针（end-labeled probe）。（p49）
32P的半衰期相对较短（14.3天）。（p51）
缺口平移标记产生的标记探针平均长度约为600nt。（p54）
使用大分子DNA模板时，随机引物法产生的探针通常比缺口平移法产生的探针长。（p58）
随机引物法可用于较小的DNA片段（100～500nt）标记，而缺口平移法对大DNA片段（>1000nt）效果最好。但随机引物产生的标记探针量比缺口平移的量要少些。（p58-59）
在进行RNA的酶促反应时，加入RNA酶抑制剂RNasin有助于确保RNA的完整性。（p61）
单链RNA探针不会自身退火。（p63）
杂交完成后，可利用RNA酶除去未杂交探针，以降低本底。（p63）
为了减少杂交干扰，在使用这些前体接尾的探针时，应将靶样品在过量未标记多聚(dA)或多聚(dT)存在下预杂交。（p70）
T4多聚核苷酸激酶方法标记5'端寡聚核苷酸最常用于DNA序列测定。（p71-72）
用乙酸铵和乙醇沉淀DNA是一种方便的分离DNA方法，因为蛋白质在2M乙酸铵中不沉淀，因而可从上清液中除去。（p75）
对于非常稀的DNA溶液（少于10μg/mL），在加入乙醇之前可加入10μg酵母tRNA，以增加沉淀效果，tRNA并不干扰随后的杂交反应。（p75）
10%三氯乙酸（TCA）可用于沉淀核酸。（p76）
当放射性探针的比活性为(1~5)×109cpm/μg时，非放射性探针大约和32P标记的探针一样灵敏。但若和比活性等于或大于1010cpm/μg的探针相比其灵敏度就差些。（p78）
非放射性核酸标记方法的比较：（p79-80）
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生物素标记和检测方法可以使探针检测到低至0.5~2pg或约5×104拷贝的靶核酸分子。（p82）
有三种商品化的修饰dNTP可供使用：生物素-dUTP、生物素-dATP和地高辛-dUTP。（p82）
用于非放射性核苷酸探针制备和检测的商品试剂：（p83-84）
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由于dNTP的锂盐比钠盐在含水乙醇中有较大的溶解度，故在乙醇沉淀过程中用LiCl可以更好地将DNA和可溶性核苷酸分开。（p85-86）
点杂交：制备含有系列稀释的均一靶分子的检查条，然后用新标记的探针在200ng/mL浓度下过夜杂交。（p86）
交联可以用80℃真空烘烤1h。（p87）
长度为0.5kb到3kb的探针在用接尾法标记时能产生最佳信号，3'突出的末端也能最有效地进行接尾（即在用PstI酶切后）。（p90）
TUNEL[terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)-mediated dUTP-X nick end-labeling]标记法，其原理是，凋亡细胞DNA断裂点出现游离3'OH，在由末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核苷酸和二价钴离子组成的反应体系中，TDT能将（标记的）脱氧核苷酸掺入到DNA断裂点游离的3'OH上。（p98）
一般认为坏死细胞TUNEL标记虽然阳性，但显色的程度较淡。（p100）
若与非靶分子区域的同源性大于70%或超过8个连续碱基，该探针序列就不应该使用。（p103）
cDNA、cRNA和寡聚核苷酸探针的优缺点：（p104）
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在过量探针的情况下，杂交速率主要取决于探针的长度（复杂性）和浓度。超过500碱基长度的探针将需要很长的杂交时间，这说明使用相对较短探针和杂交促进剂的重要性。（p105）
用32P标记探针进行杂交时，其灵敏度的浓度范围大约为1～100ng/mL，非放射性标记的探针为25~1000ng/mL。但超过一定浓度后其敏感性并不增加，但此时只会增加背景反应，地高辛标记的cRNA探针在0.5μg，生物素标记的cRNA在1~2μg，3H和35S同位素标记的cRNA探针分别为105cpm和107cpm/20μL，为敏感度的上限。（p106）
洗涤温度愈接近杂交体的变性温度（Tm），洗涤条件愈严格。（p107）
一般来说，杂交温度=Tm-25℃。（p107）
Tm=81.5+16.6lgM+0.41(G+C)-500/N-06.1(formamide%)，其中M=[Na+]（mol/L），N=探针的复杂度（长度）（p107）
其他影响Tm的因素有：①同源性（克隆探针）每降低1%，Tm降低1.5%，这种效应对于15~150个碱基的寡核苷酸探针更明显；②RNA:DNA杂交分子的Tm值高出10~15℃；③RNA:RNA杂交分子的Tm值高出20~25℃。（p107）
对寡聚核苷酸探针，杂交温度通常低于Tm5℃，对于14~20个碱基的寡核苷酸，经验公式：Tm=4℃×GC碱基对+2℃×AT碱基对（p108）
杂交促进剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇（PEG）、聚丙烯酸（钠）、苯酚、异硫氰酸胍（p109）
一般探针长度在200~600bp比较好。（p110）
当检查RNA靶分子或使用RNA探针时，最好使用酸洗过的载玻片。（p112）
粘附剂：3-氨丙基三乙氧基硅烷（APES）、聚L-赖氨酸、铬矾明胶液、Vectabond粘附剂（p113-114）
由于组织细胞离体后会很快发生自溶，组织细胞中核酸酶会降解靶核酸，所以新鲜组织或培养细胞最好尽快固定（30min内）。手术标本取出后应该迅速用冰浴降温以缓解靶核酸的降解，动物标本可以进行原位灌流固定。（p114）
沉淀固定剂：如乙醇、乙醇:乙酸(3:1)或甲醇，有使细胞形态改变的倾向，但这些试剂也可使组织细胞的通透性增加因此产生高强度信号。然而采用沉淀固定剂不能很好地固定RNA，操作过程中组织细胞容易从载玻片上脱落。乙醇:乙酸(3:1)对于DNA的保留非常有效，通常比采用交联固定剂如福尔马林产生更强的杂交信号。（p115）
交联固定剂：如甲醛、多聚甲醛或戊二醛，可牢固地将RNA或DNA固定在细胞内。这些固定剂可交联蛋白质并烷化单链核酸上碱基的氨基基团，所形成的网络对于保持细胞形态非常有效，但可能会阻止探针以及检测试剂的扩散。（p115）
采用在4%多聚甲醛中固定1min并将载玻片放在70%乙醇中的方法，可获得最好的交联度和RNA序列的有效检测。（p115）
冷冻切片能更好地保存核酸，并且更容易被检测。（p119）
福尔马林固定、石蜡包埋的组织可在室温无限期贮存。载玻片可置4℃干燥保存长达数月。（p120-121）
目前敏感性高、分辨率好的染色体原位杂交技术是FISH即荧光素原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization）。这类分析的主要要求是制作良好的G-分带染色体中期扩散相。（p121）
载玻片上分散染色体：用移液器将细胞从50cm左右的高处滴在载玻片上，使染色体散开。（p122）
细胞内特异蛋白质分子的数目通常远远超过编码它们RNA分子的数目，因此一般免疫细胞化学的灵敏度比原位杂交要高。（p124）
原位杂交的放射性标记：①3H标记探针是合适的，因为其具有长的半衰期和贮存期，而且杂交信号容易通过放射自显影定位，但它的比活力通常比较低，因而仅适用于多拷贝（每个细胞100~1000个拷贝）或（>10kb）基因的检测。②35S标记的探针具有高比活性（>10cpm 108），并且在放射自显影后产生清晰影像。③用32P标记的探针具有高比活性，但同位素放射会产生非常弥散的颗粒，使得对杂交点定位发生困难。④用125I标记的探针，由于其低能量的二级β射线，所以能给出高分辨率和高特异性。（p125）
湿润室：（p126）
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原位杂交的几种预处理：①0.1M PBS（pH7.2）：清除残留于组织中的固定液。②0.1M甘氨酸 in PBS：除去组织中游离醛基。③0.4% Triton X-100 in PBS（或0.2M HCl）：增加探针的渗透力。④1μg/mL蛋白酶K in PBS：暴露待测mRNA。⑤4%多聚甲醛 in PBS：终止蛋白酶K的作用。⑥0.25%乙酸酐 in 0.1M三乙醇胺（或Denhardt溶液）：降低非特异性反应。（p126-128）
原位杂交两种染色方式：①片染法（贴片法）：将组织薄片粘贴在载玻片上进行染色。②漂染法：将组织薄片漂浮在盛有溶液的容器中进行染色。漂染法的敏感性方面要比片染法高，并且重复性好，杂交环境稳定。（p126-127）
NBT和BCIP显色液中，室温暗处显色1~36h。显色时应该不时地在显微镜下进行检查直至达满意的显色结果。（p129）
地高辛标记RNA探针ISH和IHC联用：第一抗体孵育液含两种第一抗体。（p133）
免疫组织化学显示的抗原部位着棕色（DAB显色液），原位杂交组织化学显示的核酸部位着紫蓝色（NBT和BCIP显色液），二者兼有的部位为棕色和紫蓝色的混合色。（p136）
冰冻切片和石蜡包埋组织切片的原位杂交技术程序有所不同，主要表现在蛋白酶的浓度及处理时间和酸处理的不同。（p138）
电镜水平原位杂交常用的标记物是生物素和地高辛，而其显示系统一般是过氧化物酶和胶体金。（p153）
原位PCR中，每个组织切片滴加30μL PCR扩增反应液，用硅化盖片覆盖，周围用石蜡油封边。（p159）
原位引物延伸标记（primed in situ labeling，PRINS），又称寡核苷酸引物延伸法（oligonucleotide priming method），其原理是将未标记的寡聚核苷酸与组织细胞中待检测的靶核酸顺序进行杂交，然后以寡聚核苷酸为引物，在Klenow多聚酶的催化下，将标记核苷酸掺入到寡聚核苷酸3'末端。然后用相应的检测系统在原位显示靶核酸顺序。（p164）
原位杂交的阴性对照：①竞争抑制对照实验。②正义（sense）RNA探针。③用RNA酶处理待测标本。④杂交液中不加探针。（p166-167）
脱片可能的原因：载玻片清洗不干净；蛋白酶K处理过度；切片贴片时出现较大气泡；杂交温度过高。（p168）
非特异性着色可能的原因：探针浓度过高；探针非特异性结合高；杂交温度过低；杂交后冲洗不充分；内源性酶未处理完全；抗体浓度过高或过期失效；显影时间过长。（p168）
无阳性结果可能的原因：探针降解；切片中待测核酸降解；杂交前液体被核糖核酸酶污染；蛋白酶K失活；组织中待测核酸含量极少。（p169）
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对于一幅黑白图像，像素代表图像在该位置上的灰度等级，0级代表黑色，255代表白色。一般人眼能分辨的灰度级仅为15~25，所以计算机的分辨能力远比人眼强。（p173）
只有实验操作的严格一致，实验组与对照组间原位杂交结果的定量分析才具有可比性。如果是片染法，实验组和对照组的切片最好裱在同一载玻片上；如果用漂然法，实验组和对照组的切片最好在同一容器中进行处理，这时可以将对照组和实验组的切片切成不同的形状以便区分。（p175-176）
因为非核素原位杂交组化往往需要2~3级放大，实验步骤较多，很难标准化，因此在定量分析中应用并不广泛。（p177）
杂交信号的区域灰度值=被检测区域的灰度值-背景区灰度值（p178）
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