细胞凋亡｜译

本篇译自Abcam的Apoptosis assays and markers guide

全篇很长，目录列在下面，方便备查：

细胞死亡
凋亡
- 凋亡机制
- 主要标志物
凋亡检测
- Bcl-2家族前凋亡组分的激活
- 膜不对称性的丢失
- Caspase（半胱氨酸蛋白酶/凋亡酶）
- 抗体检测法
- 底物检测法
- Calpain(钙激蛋白酶)和Cathepsin(组织蛋白酶)
- 线粒体跨膜电势
- 细胞色素C释放
- 染色质集聚
- 基因组DNA片段化
- sub G1群的增加
- 细胞膜泡状化
凋亡实验的tips
- 凋亡诱导剂和抑制剂的使用
- 检测单细胞
- 小心不同细胞株之间的差异
一般考虑
参考文献

以下正文：

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细胞死亡

当细胞无法维持重要的生命活动就会死亡：损伤或外伤导致的非程序性死亡和程序性细胞凋亡或自噬。

细胞死亡可以根据多种标准进行分类：形态学（凋亡和坏死）、酶学标准（是否有蛋白酶参与）、功能学（程序性的、非程序性的），或者免疫学特征（免疫原性的、非免疫原性的）等。

在研究细胞死亡机制之前，研究者需要首先确认细胞死亡真实发生了。命名委员会把具有如下特征的细胞定义死亡细胞：

1. 丧失细胞质膜的完整性

2. 细胞经历了完全的裂解

3. 在体内，细胞最终为临近细胞所吞噬

本手册旨在介绍细胞凋亡，也是研究最为广泛的细胞死亡类型，包括最常用的评价细胞凋亡的参数以及研究方法和工具。

凋亡

凋亡是一种程序性细胞死亡模式，在众多正常生理过程中都很重要。历史上，John Kerr在上世纪70年代详细描述过凋亡的形态学特征。凋亡的形态学包括细胞萎缩、细胞膜空泡化、染色质集聚（pyknosis/核固缩）、核片段化（karyorrhexis/核碎裂）、DNA断裂以及细胞最终为吞噬泡所吞噬。和坏死不同，凋亡细胞不引起炎症反应，在体内也只有个别细胞经历凋亡。

- 凋亡机制

凋亡最大的特征是激活半胱天冬氨酸蛋白酶家族成员（Caspase），后者可以限制性水解超过400种蛋白。凋亡起始的两个主要通路，内源性和外源性通路，最终都会导致Caspase的激活。

细胞凋亡的内源性通路是Bcl-2家族蛋白控制的，它通过控制线粒体膜透过性来启动细胞凋亡。一些细胞内的死亡信号，如DNA损伤、原癌基因的激活、生长因子匮乏、内质网应激、微管的破坏等等，传递信号给内源性通路。内源性细胞死亡通路的关键步骤是线粒体外膜的透性化，跨过这个步骤，细胞死亡就无可避免了（point of no return）。

透性化之后，线粒体内膜空间的多种蛋白释放促进了Caspase的激活和细胞凋亡。其中，细胞色素C结合凋亡水解酶激活因子-1（APAF-1），后者寡聚合形成凋亡小体，凋亡小体招募并激活先导Caspase，Caspase-9。Caspase-9水解并激活执行Caspase，Caspase-3和Caspase-7，最终细胞凋亡。

外源性细胞凋亡的发生多由胞外死亡信号与细胞膜上的“死亡受体”结合所启动，这些死亡信号分子包括Fas、TNFR1或者TRAIL等。而死亡受体有两个明显的基序，死亡结构域（DD）和死亡效应结构域（DED），通过这两个结构域，死亡受体可以招募并结合其他的接头分子，如FAS相关的死亡结构域蛋白（FADD）可以结合Caspase-8，而后者可以直接水解并激活Caspase-3和Caspase-7，启动细胞凋亡。

（点击文首的链接可以看到内源性和外源性细胞凋亡通路的图解）

- 主要标志物

细胞凋亡的发生经历了一系列复杂的信号传导，并有多个严密监控的检查点，这为我们提供了多个检测相关蛋白的机会。

细胞凋亡

上图描述了细胞凋亡过程中的主要事件发生的相对时间。这些事件并不是依次先后发生的，它们彼此相互叠加甚至有些完全重合。细胞膜不对称性的丢失和Caspase组件的激活是细胞凋亡生化水平的起始，但不意味着细胞一定会死亡。但是，其他的下游事件，如线粒体膜电势（ΨМ）的下降和随之而来的细胞色素C释放如细胞质，被认为是不可逆转的关键点，发生之后，细胞经无法逆转凋亡的趋势。

接下来的章节，我们将讲述检测细胞凋亡的各种工具，以便你根据自己的样品和条件来选择适合的方法。

凋亡检测

- Bcl-2家族前凋亡组分的激活

Bcl-2家族由一系列进化上非常保守、共用一个或多个Bcl-2同源（BH）结构域的蛋白组成。因BH的不同，这些成员要么推动要么抑制细胞凋亡。抗凋亡成员，如Bcl-2和Bcl-X(L)，保留了4个BH结构域；前凋亡组分，如Bax，Bak或Bad，通常只有BH3结构域，而其他的结构域都丢失了。

一般情况下，抗凋亡和前凋亡成员之间呈动态平衡。当内源性凋亡途径启动，一些前凋亡成员会二聚化、在线粒体外膜上打孔、导致APAF1/其他线粒体蛋白的释放，进而启动下游Caspase等蛋白的活化。

一个用来检测Bcl-2前凋亡蛋白活化的简便方法是使用特异性抗体通过WB的方法检测蛋白表达水平的变化。如下WB图，即阿司匹林（aspirin）作用后，小鼠脾脏和肝脏中Bax表达水平的变化。

不过，蛋白表达水平在某种细胞类型或者损伤情况下并不一定会发生变化。在这些情况下，可以采用如下的方法检测Bcl-2前凋亡蛋白的活化：

检测与前凋亡蛋白形成寡聚体的其他前凋亡蛋白：采用免疫共沉淀的方法，通过钓取一个蛋白来检测它的寡聚结合体的WB方法。

检测线粒体定位的活化蛋白：细胞亚组分的WB检测，或采用免疫荧光法检测目标蛋白，同时联合使用线粒体染料，进行定位。

- 膜不对称性的丢失

细胞膜不对称性的丢失是细胞凋亡的早期信号，这时，原本在质膜内侧的PS（磷脂酰丝氨酸）会出现在质膜外侧，表现为凋亡信号。

Annexin V（一种人胎盘蛋白）在Ca2+存在的条件下可以特异性结合PS。使用荧光基团偶联的Annexin V可以用来检测/定量发生外翻的PS。荧光显微镜或者流式都可以进行检测，前者较为直观，后者可以精确定量。

Annexin V染色法还可以和PI或7-AAD等染料联用，用来区分细胞凋亡和坏死。下表列举了不同染色结果组合对应的细胞情况。

细胞状态判断

有报道称PS外翻不光是细胞凋亡的早期表现，在细胞坏死（necroptosis7）时也会发生。所以，检测细胞不对称性丢失只能作为细胞凋亡的验证性手段，需要和其他凋亡检测方法联用。

（附Annexin V检测凋亡protocol，此处略去，如需要请参照原文）

- Caspase（半胱天冬氨酸蛋白酶/凋亡酶）

Caspase家族是非常保守的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡中起到关键作用。哺乳动物Caspase按功能可以划分为3类：起始caspases（Caspase-2，-8，-9和-10），执行caspases（Caspase-3，-6和-7）和炎症性caspases （Caspase-1，-4，-,5，-11和-12）。顾名思义，起始caspases负责启动凋亡信号，执行caspases负责执行一系列的蛋白水解。炎症性caspases不参与细胞凋亡，但是在炎症细胞因子信号通路以及细胞炎症性坏死等过程中起重要作用。

Caspases以无活性的pro-caspases形式先被合成，一旦接受到颗粒酶B、死亡受体以及凋亡小体的信号，立即被剪切并激活。激活的Caspases会水解一系列底物，包括下游的caspases、核蛋白、质膜蛋白、线粒体蛋白等等，最终导致细胞死亡。

有多种方法可以检测caspases的激活，如下表所示。多个实验方法给出的答案可以证实某一种或多种caspases的活化状态。推荐使用多个检测方法确认caspases活化情况。

- 抗体检测法

本检测方法高度依赖于抗体的特异性和针对抗原表位的位置，所以为正确的方法选择正确的抗体至关重要。

本条目下举了两个例子进行说明。WB使用了能够识别在Caspase-3前体和活化形式中共同存在的抗原表位的抗体，这样电泳图中同一泳道可以表现出两个蛋白——前体酶和活化酶——表达量的变化。而使用荧光染色方法检测Caspase-3时就要使用特异性针对活化后Caspase-3的抗体，以保证只有发生了凋亡的细胞可以被染色。

（原图略去）

- 底物检测法

用于检测Caspase的底物通常为较短的多肽，共价偶联了可见光/荧光探针，具备可以被Caspase特异性识别的水解位点。被同族的Caspase水解后，偶联的探针被释放，通过检测光吸收/荧光即可定量Caspase的活化水平。不过，一些Caspase能够识别的水解位点是相似的，所以该方法特异性不强。例如，Caspase-3和Caspase-7的水解位点就非常相似。在这种情况下，使用特异性的激活剂或抑制剂就非常有必要了。

另一个需要特别关注的点是你选择的样本中是否有要考察的Caspase酶。如乳腺癌细胞MCF-7就缺乏Caspase-3，所以，检测该细胞中Caspase-7的活性就比较合适。

Caspase活性检测

- Calpain（钙激蛋白酶）和Cathepsin（组织蛋白酶）

凋亡中的主要蛋白酶即Caspase。不过在某些细胞中，其他蛋白酶如Calpain和Cathepsin对凋亡的调控也很重要。

Calpain是一种非溶酶体钙离子依赖型半胱氨酸蛋白酶，由一个或两个亚基组成。它识别的水解位点并非一级结构依赖而是具有高级结构特异性。在上皮细胞中，Calpain-1水解Bid，导致细胞色素C释放，而在心肌细胞中，Calpain-1被发现在TNF诱导后激活Caspase-3和PARP，不过Calpain调控细胞凋亡的机制目前还不清楚。

Calpain活性可以通过偶联了可见光/荧光探针的特异性引物来检测。底物被水解后，探针释放，相应的光吸收/荧光信号与酶活性呈正相关。检测过程中，需要注意如下几点：

1. 确保样品中没有污染溶酶体或其他富含蛋白酶的细胞器，否则会产生假阳性。必要时可以使用溶酶体蛋白酶（Cathepsins）抑制剂以降低非特异性酶活的检出。

2. 使用Caspase抑制剂（如z-FA-FMK）以区分不同半胱氨酸蛋白酶活性。

3. 细胞样品使用Calpain特异性抑制剂作为空白对照孔，以保证反应体系中检测的是Calpain酶活性。

4. 细胞本底表达一定的Calpain酶活性，所以使用未处理的细胞的Calpain活力作为反应的背景值。

5. Calpain酶活性不能够作为细胞凋亡的指征，它在细胞坏死的时候也会被激活。合适的对照十分重要！

Cathepsin在所有动物中都有发现。大多数的是半胱氨酸蛋白酶（Cathepsins B, F, K, L, S），只有Cathepsin D是天冬氨酸蛋白酶，Cathepsin G是丝氨酸蛋白酶。Cathepsin通常存在于溶酶体。在溶酶体的低pH值环境下，Cathepsin被激活，以往一直认为Cathepsin与坏死相关。某些Cathepsin在胞质的中性环境下也保持活力，并与TNF-alpha活化Caspase-8的凋亡信号通路相关，尽管Cathepsin在不引起线粒体变化/没有Caspase参与的情况下也可以导致细胞死亡。

与caspase和calpain活性检测一样，多种细胞样品的Cathepsin的活力检测也可以通过偶联探针的特异性底物实现。

如下几点需要注意：

1. 使用cathepsin抑制剂。

2. 使用caspase抑制剂。不过很多caspase的抑制剂，如z-FA-FMK同样抑制cathepsin活性，一定要使用合适的对照。

3. cathepsin同样参与坏死过程，同样不能作为凋亡的指征。

- 线粒体跨膜电势

凋亡最明显的特征是线粒体功能的破坏，特别是线粒体跨膜电势（ΨМ）的改变。ΨМ对于呼吸链合成ATP的生理功能的维持至关重要，一旦线粒体膜通透性转换孔（MPTP）打开，ΨМ就不复存在，随之而来的就是细胞色素C的释放。

线粒体膜电势通常采用阳离子型荧光染料来检测，因为这种染料可以聚集在线粒体阴离子基质侧。染料聚集程度与ΨМ呈反比：电势越负，染料聚集越严重。因此，健康细胞的线粒体能够聚集更多的染料，而凋亡细胞则很少。

染料可以通过荧光显微镜定性观测或者使用流式细胞仪/酶标仪定量。如下表格列举了常用的探针染料。

线粒体的探针染料

FCCP是一种离子型的氧化磷酸化的解耦联剂。使用FCCP处理细胞可以使线粒体膜电势去极化，是非常好的阳性参照物。

- 细胞色素C释放

ΨМ的消失是一个非常严重的事件，在这之后，MPTP打开，细胞色素C释放入细胞质，细胞凋亡不可逆转。有研究发现即使MPTP不打开，细胞色素C也会释放，不过个中机制仍然不明。

检测细胞色素C最常用的方法是WB。由于样品为提取的亚细胞组分，保证亚细胞组分不被污染十分重要。下面列出了几种常用的检测提取组分特异性的指标：

细胞质蛋白marker：GAPDH，actin

线粒体蛋白marker：VDAC1，PDH-E1

Douglas Green实验室创建了GFP偶联的细胞色素C，可以用延时荧光显微镜观察到不同类型的活细胞在凋亡过程中色素C释放的过程。对固定好的细胞，使用细胞细胞色素C特异性抗体，用免疫荧光染色的方法，也可以观察到细胞色素C从线粒体到胞质的释放过程。

需要注意的点：

1. 时间：做预实验确定你使用的细胞株检测的最佳时间点。

2. 对照：如果你想证明细胞色素C的释放是由于细胞凋亡诱导剂引起的，而不是线粒体功能失常的产物，一定要使用合适的阳性对照（发生了细胞凋亡的细胞）和阴性对照（抑制该过程的试剂）

（多个例子省略）

- 染色质集聚

细胞凋亡发生时，染色质也经历一个从多样化、有遗传功能的结构过渡为无活性、集聚的形态。使用可与DNA结合的核染料染色就会发现，集聚的染色质明显比没有发生凋亡的细胞内的染色质亮很多。这种染色很容易通过荧光显微镜定性观察和/或流式手段进行定量。

- 基因组DNA片段化

集聚的染色质会被一种特定的核酶（caspase-activated DNase, CAD）水解成片段。被caspase活化的CAD组件会特异性地在核小体内linker位点剪切核小体，形成许多200bp大小的DNA

ladders（电泳条带呈梯子形态）。

（此处省去基因组DNA ladders检测方法）

传统方法使用agarose电泳来检测DNA

ladders。这是一个半定量的方法，已经渐渐不再使用，但它仍然是一个可以简单快速知道基因组DNA是否发生片段化的手段。

取而代之的是使用TdT dUTP进行缺刻末端标记的方法（TUNEL）。在caspase激活的脱氧核糖核酸酶制造了很多缺刻后，末端脱氧尿嘧啶核苷转移酶（TdT）可以把双链DNA（缺刻）的3’端标记为脱氧尿嘧啶核苷，如果使用了荧光标记的脱氧尿嘧啶核苷，那么荧光标记程度就可以反映出基因组缺刻的多少。

荧光显微镜或者流式法可以检测TUNEL标记后的结果。

- sub G1群的增加

DNA片段化的一个结果就是越来越多的细胞停滞在G1期，而这可以通过流式的方法检测到。如果使用70%的乙醇固定细胞，细胞的通透性增加，DNA片段从核中渗漏出来进入细胞。然后使用DNA染料，如PI染色，不同DNA含量的细胞即处于不同的细胞周期（G1期，S期，G2M期）。而凋亡细胞多处于subG1期（G1期的左侧）。但是所有的细胞死亡都有类似的表现，该检测方法属于验证实验。

- 细胞膜泡状化

除了DNA片段化之外，细胞凋亡最后阶段还表现为形态上的细胞膜泡状化和细胞收缩。凋亡后期，细胞骨架破坏，引起部分细胞膜向外凸起。凸起最终会脱离细胞，带走一部分的细胞质，形成所谓的凋亡小体。

使用相差显微镜可以观察到活细胞中出现的膜泡状化。如果没有活细胞，比如你使用DNA片段化检测所收集的样本，你可以检测细胞膜泡状化相关的caspase底物。注意，这是一个间接的手段，可能出现假阳性/假阴性。

细胞膜泡状化相关的caspase底物有：

-Gelsolin

-ROCK-1 激酶

-P21激活的激酶（PAK）

凋亡实验的tips

有很多因素会影响凋亡检测的成功，以下介绍部分tips。

- 凋亡诱导剂和抑制剂的使用

使用特定阶段凋亡组分的诱导剂或抑制剂作为实验的阳性或阴性对照，对于验证实验体系正常、确认凋亡发生十分重要。

常用的诱导剂/抑制剂

- 检测单细胞

诱导凋亡后不同凋亡事件的检测所需时间通常也不同。如Jurcat细胞，Fas抗体处理后4hr可以检测到Caspase-8活性，而Caspase-3活性检测需要等到20hr之后。

caspase激活在体外细胞凋亡过程中通常较体内发生得更早，而永生化细胞也比原代细胞更早启动凋亡信号，监测这些时间点很有必要。细胞群中的细胞会处于不同的细胞周期，这意味着群体中的单个细胞所处的细胞凋亡阶段也会不同。例如，刚刚结束分裂的细胞会比已经完成DNA分裂（S期）的细胞更晚进入G2M停滞期。因此，如果可以追踪到单个细胞的凋亡事件，并对此进行分析十分重要。

错过最佳时间，可能会检测不到或者检测到很低的信号，最终导致得出错误的结论。所以进行时间进程实验来确定给定事件的最佳检测时间点就很重要了。

- 小心不同细胞株之间的差异

不同细胞株对于同一测试条件会有不同的反应，对于某些细胞来说，某个处理条件会诱发凋亡，而对另外的细胞却未必。如果使用了缺乏某种蛋白的细胞，可能会导致某个凋亡事件被低估。如我们前面提过，乳腺癌细胞MCF-7缺乏功能性的Caspase-3，所以检测其中的Caspase-3活性就不会有任何结果。

一般来说，凋亡诱导剂处理体外培养的细胞会比组织中细胞更早发生凋亡信号（可能是几小时和几天的区别）。组织中的细胞甚至可能不经历某些晚期的凋亡事件，因为还不等那些事件可以被检出，这些细胞就被吞噬了。

一般考虑

如本指南一直指出的，确认细胞死亡为细胞凋亡最好要同时检测多个指标。因为同一指标可能会发生在多种细胞死亡类型中。

敲黑板：

-选择凋亡指标时，必须确认其与你的实验条件相关。

-设计一个浓度梯度实验，确认测试样品的合适浓度和作用时间

-处理步骤越少越好

-发表的文献/protocol提供了重要的参考，但不要完全依赖它们

-实验室之间的小差异也会导致结果不同

备忘录：

细胞调亡检测方法

参考文献（20篇-略）