Cell Ranger 知多少？（上）
Cell Ranger 知多少？（中）
单细胞测序基因比对的理论模型
Reads 的修剪
针对 3’ 建库数据的基因表达比对，在比对之前会先对 reads 进行修剪。
cDNA 的全长结构中，在 3’ 和 5’ 端分别带有 poly-A 尾和TSO 序列结构（相对于比较长的 RNA 分子，一部分来自短 RNA 分子的 reads 可能仅包含 TSO 和 poly-A 序列的其中一种）。由于这种低复杂度的非模板序列的存在有可能混淆 reads 的映射，所以在比对之前一般会将 poly-A 尾和 TSO 序列分别从 reads 的 3’ 端和 5’ 端切除，这一步骤有助于提高分析的灵敏度和软件分析的效率。
如何判断 reads 比对到了基因组？
Cell Ranger 中封装了比对软件 STAR，根据转录本的注释文件 GTF 中的注释信息，使用 STAR 来判断reads 是比对到了外显子、内含子还是基因间区上，或者说来判断 reads 是否比对到了基因组上。
当一条 read 至少要有 50% 碱基序列与基因组上的外显子碱基互补配对，认为其比对到了外显子上；若 reads 未比对上外显子但与内含子相交，则认为其比对到了内含子上；否则为比对到了基因间区。若 reads 比对到了一个单一的外显子位点，但同时比对到了一个或多个非外显子位点，则优先认为该 read 比对到了外显子位点，MAPQ 为 255。
如何判断 reads 比对到了转录本？
Cell Ranger 通过检测 reads 比对上的外显子和内含子与转录本的相容性，进一步将 reads 与注释的转录本对齐。如下图所示，reads 根据它们是正义还是反义，以及它们是外显子还是内含子，或者它们的剪接模式是否与该基因相关的转录本注释兼容来分类。
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上图中，绿色展示的是基因及基因中所包含的外显子，Transcript 1 和 Transcript 2 为基因经过可变剪切形成的两种转录本所包含的外显子。针对比对到正义链上的reads，如果 reads 比对到了一个外显子上或者比对到两个相邻的外显子上，则该 read 被分类为转录本 read（蓝色）；如果 reads 比对到两个不相邻的外显子上，则该 read 被分类为外显子 read（浅蓝色）；如果 reads 比对到内含子区域，则该 read 被分类为内含子 read（红色）；紫色表示 reads 比对到反义链上。
小知识（敲黑板）
在默认情况下，只有蓝色的转录本 read 会被计入到 UMI 计数中。但在某些情况下，如在实验时输入的为细胞核时，未剪接的转录本有可能产生高水平的内含子序列，为了将这些内含子 read 计入，cellranger count 可以添加一个参数为 include-introns。当使用该参数时，任何比对到单个基因的 reads ---- 包括转录本 read（蓝色）、外显子 read（浅蓝色）和内含子 read（红色）都会计入 UMI 计数中。
此外，只有在基因组上有唯一比对位点的 reads 才被计入到UMI计数中。
如何进行 UMI 计数？
1. 在计算 UMIs 之前，Cell Ranger 会试图矫正 UMI 序列中的测序错误。
在转录本上有唯一比对位点的 reads 根据他们的barcode、UMI 和比对到的基因被分成不同的组。如果两个组的 reads 拥有相同的 barcode 序列并比对到同一个基因上，但是 UMI 序列中有一个碱基不同，那么其中一个 UMI 有可能是因为测序中的碱基替换错误而引入的。在这种情况下，UMI 的reads 数量少的那一组会被更正为 UMI 的reads数量多的那组。
2. 矫正可能的测序错误后进行 UMI 计数。
Cell Ranger 会再次按照 UMI（可能是修正后的）、barcode 和比对到的基因对 reads 进行分组。如果两组或者多组的 reads 拥有相同的 barcods 和 UMI 序列，但是比对到了不同的基因上，那么 reads 计数最高的那组比对到的基因会被进行 UMI 计数，其他的组则被舍弃掉。如果 reads 最高计数相同，则全部的组都被舍弃掉。
经过这两步过滤步骤后，每一个被统计到的barcode、UMI 和 基因都会被保存在未过滤的 feature-barcode 矩阵中，输出在 unfiltered feature-barcode matrix 文件夹中。
Cell Ranger 是如何进行细胞计数回收的
在基于 droplet 方法的单细胞技术中，通常认为含有细胞的液滴应该含有更多的RNA，因此其在 UMI 总量上应该与空细胞（背景噪音）存在明显的区分（也就是我们常说的 barcodes 排序图上的拐点）。然而实际上微滴间不同的扩增效率会导致一些较小的细胞跟空细胞在 UMI 总数上是相近的，无法仅通过 UMI 总数很好地区分空细胞和非空细胞。尤其当样本中混杂了不同大小的细胞，例如在肿瘤样本中一般混杂着体型较大的肿瘤细胞和较小的肿瘤浸润淋巴细胞，浸润淋巴细胞则较难与空细胞区分。
为解决这一难题，Cell Ranger 的算法采用了两步法分别基于 UMI 阈值识别高 RNA 含量细胞以及基于表达谱识别低 RNA 含量细胞。
1. 第一步，选取一个 UMI 总数的阈值，所有大于这个阈值的 barcodes 被识别为细胞。这一步保证了高 RNA 含量的 barcodes 被保留。****
具体的算法是：将 UMI 计数从高到低进行排序，根据预期细胞数 N（软件默认N=3000），排名前 N 个细胞中的 99 分位 UMI 数值记为 m，将所有 UMI 计数大于 m/10 这一阈值的 barcodes 标记为高质量细胞。
2. ****剩余未通过阈值的 barcodes 则进行第二步的筛选，根据与空细胞 RNA 表达谱是否存在显著差异来回收潜在的低 RNA 含量细胞。
此算法基于 Lun et al. 2019 年发表的算法 EmptyDrops。
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a. 首先选取一组低 UMI 计数的 barcodes 作为背景集（来代表空细胞），用这部分 barcodes 的表达谱构建一个"背景模型"。
Tips：构建背景模型的 barcodes 的选取：
（1）低于一个 UMI 阈值 T 的所有 barcodes，这个 T 需要足够小，使其不会包含任何真细胞（注意此阈值 T 与 m/100 阈值的区别）；
（2）选取的 barcodes 数量要够多，以满足一个精确的背景模型计算。
具体的算法先计算了背景集所有 barcodes 中每个基因的 UMI 总数，接着使用 Good-Turing smoothing 算法为所有的基因估算一个非零的概率（此算法的优势在于也可为那些没有在背景集中被检测到基因进行估算，而这些基因可能会出现在真细胞的数据中），现在就得到了这个关于各个基因 UMI 计数的多项分布模型。
b. 接着将在第一步骤中所有未被标注为高质量细胞的 barcodes 依次和背景模型相比较，那些与背景模型存在显著差异的细胞会被回收到高质量细胞的行列。
具体的计算采用了 Monte Carlo 方法，在背景模型中进行随机抽样，通过多次循环模拟计算得到某一 barcodes 计数的 p 值。
下图是一群高 RNA 含量的 293T细胞和一群低 RNA 含量的 PBMC 细胞的混合样本数据。可以看到在被标记为高质量的部分出现了两个群体（由第一个拐点A 大致分开），在第二个拐点 B 附近的区域同时包含空细胞和高质量细胞，这部分细胞即为从第二步中回收出的细胞，图片中颜色的深浅代表了局部高质量细胞的比例。
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所有被回收的高质量细胞的矩阵，会被输出到 filtered_feature_bc_matrix 文件夹中，根据矩阵信息进行下游分析。
以上就是 Cell Ranger 进行细胞计数并回收的基本原理，你 get 了吗？相对而言，本篇文章中的原理可能晦涩难懂了些，不完全理解也没有关系。下篇文章，我们重点对 Cell Ranger 输出的结果进行解读，相信一定能解开很多人的心头困惑，敬请期待吧~
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