之前发过一个ATMT的综述，这篇文章会有一些具体的操作方法【现学现卖】review农杆菌介导的真菌转化
Agrobacterium-MediatedTransformation of Fusarium oxysporum: An Efficient Tool for InsertionalMutagenesis and Gene Transfer(Mullins etal., 2001)农杆菌介导的尖孢镰刀菌的转化
简介
农杆菌介导的转化（Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation (ATMT)）一直被用在植物细胞的转化实验中，这篇文章以尖孢镰刀菌为例，构建了4个双载体系统，并且优化了ATMT操纵真菌基因，构造插入突变体的实验条件。实验发现转化效率受真菌孢子和农杆菌共培养时期农杆菌数量的影响最为显著。
材料与方法
真菌材料
F. oxysporum strain O-685，在22℃下连续12d荧光灯照射，并使用CLA培养基（康乃馨叶片水琼脂培养基，康乃馨叶片干燥，灭菌，撒在水琼脂上。也可以用CMC或者绿豆培养基），诱导真菌分生孢子产生。用无菌水冲洗培养的菌落表面并用移液器收集，并用一种滤布Miracloth(CalbiochemBehring, La Jolla, CA)过滤掉大一些的菌丝体，获得孢子悬浮液(1 ×106 conidia per ml)。
构建载体
所有的载体都是在pCAMBIA1300 (CAMBIA, Canberra,Australia)载体的基础构建的。（结果表明基础载体和改造的都可以在尖孢镰刀菌中起作用。这篇文章中用的载体比以前研究用的pUR5750，14kb小了很多）
（1）pBHt1（8.4kb）载体：用BamHI和HindIII酶切pCSN44质粒，获得1.4kb大小，携带潮霉素B抗性基因（hygromycinB resistance (hph) gene）和构巢曲霉trpC启动子的插入片段。而基础pCAMBIA1300载体则如图箭头所示，用XhoI和BstXI酶将这部分切除，接合（ligate）上述插入片段，最终得到pBHt1（8.4kb）载体。
（2）pDHt（7.1kb）载体：将基础载体按照（1）的两个酶作用后，得到的片段在没有插入片段的情况下自我连结（self-ligate）。
（3）pBHt2（8.4kb）载体：与（1）类似，但是插入序列是从pCB1004质粒里获得的。
（4）pKHt（10.6kb）载体：2.2kb大小的片段包含ColE1复制起点（replicationof origin）和氯霉素抗性（ferringchloramphenicol resistance）基因。这段序列是通过特异性引物ECO-1和PST-1扩增pBCSK (Stratagene, La Jolla, CA)得到的。在pBHt2的基础上，插入的位置是MCS（Themultiple cloning site，MCS包含EcoRI,SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, 和HindIII等位点）。
转化
（1）包含合适的双载体的农杆菌Agrobacteriumtumefaciens strain AGL-1在28℃，包含卡那霉素（kanamycin，50μg/ml）的MM培养基（Minimalmedium(g/L)：K2HP04, 2.05; KH2P04,1.45; NaCI, 0.15; MgSO4.7H20, 0.50; CaCI2.6H20, 0.1; FeSO4.7H20, 0.0025;(NH4)2S04, 0.5）中生长2d。
（2）将农杆菌细胞在IM培养基（inductionmedium: MM salts, 40 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), pH 5.3, 10mM glucose, 0.5% (w/v) glycerol, 200 µM AS）中稀释到OD600= 0.15，继续培养6h。（结果显示前培养时AS不是必需的）
（3）然后将农杆菌菌液与上述制备的孢子悬浮液1：1混合。200μl混合液平铺在消化纤维素滤纸（nitrocellulosefilter）上，滤纸放在在共培养平板上，所用培养基和IM唯一的差别是glucose含量为10 mM。25℃培养2d。
（4）滤纸转移到含有hygromycinB (75 µg/ml)，cefotaxime (200 µM)和moxalactum (100 µg/ml)的MM培养基。
（5）获得的真菌转化子分别独立的转移到24孔板里，孔里含有CLA和hygromycin B (75 µg/ml)，培养至产孢。
（6）独力转化子产生的孢子在水中稀释，涂布在含有hygromycin B (75 µg/ml)的PDA上。获得单孢菌落。并且通过多代无抗生素培养，随后再次接种在含有抗生素培养基上的方法，检测转化的稳定性（文章结果是6代仍遗传稳定）。
Transformation ofConiothyrium minitans, a parasite of Sclerotinia sclerotiorum, withAgrobacterium tumefaciens(Li et al.,2005)通过农杆菌介导将盾壳霉转入到核盘菌
这个文章同样用到了农杆菌转化，但是因为实验真菌不同，这个文章在前一篇的基础上，更改了真菌培养温度，时间；真菌孢子浓度（107 spores/ml）；孢子和农杆菌共培养时AS浓度400μM。以及一系列抗生素的浓度都根据材料有所变化。
参考文献
Li, M., Gong, X., Zheng, J.,Jiang, D., Fu, Y., and Hou, M. (2005) Transformation of Coniothyrium minitans,a parasite of Sclerotinia sclerotiorum, with Agrobacterium tumefaciens. FEMS microbiology letters 243: 323-329.
Mullins, E.D., Chen, X., Romaine,P., Raina, R., Geiser, D.M., and Kang, S. (2001) Agrobacterium-mediatedtransformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertionalmutagenesis and gene transfer. Phytopathology91: 173-180.
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