The m6A-Related Long Noncoding RNA Signature Predicts Prognosis and Indicates Tumor Immune Infiltration in Ovarian Cancer
m6A相关的长非编码RNA特征可预测预后并显示卵巢癌的肿瘤免疫浸润情况
发表期刊：Cancers (Basel)
发表日期：2022 Aug 22
影响因子：6.575
DOI: 10.3390/cancers14164056
一、研究背景
卵巢癌是一种妇科恶性肿瘤，OV是这种癌症的常见类型，在所有卵巢癌患者中，OV的发生率为百分之九十。随机试验的结果显示，经阴道超声和CA-125检测对诊断卵巢癌和改变死亡率的帮助不大。人们更加关注发现参与癌症发病和进展的关键调控基因并在此基础上构建预后特征。
最近，作为各种RNA的可逆表观遗传修饰，m6A RNA修饰在癌症发病机制、药物反应和开发新的治疗靶点中的重要作用和分子机制得到了深入的研究和证实。LncRNA是一组RNA分子。虽然lncRNA不能翻译成蛋白质，但它对许多生物过程，如肿瘤的发生和发展有重要影响。m6A和lncRNAs之间的关系正在深入研究中。广泛的研究发现，lncRNAs的生物生成和功能取决于m6A的修饰。
二、材料与方法
1、数据来源
1） 从TCGA数据集（374个样本）和GSE9891（278个样本）收集OV样本的基因表达谱和临床病理学数据
2） 不同阶段的OV样本的单基因表达来自GEPIA
3） 为了确定四个mRLs在更多癌症中的作用，从UCSC Xena数据库获得了33种癌症的泛癌症数据，包括RNA-seq、免疫亚型、预后概况和干性评分
4） OV和正常样本
2、分析流程
流程图
三、实验结果
01 - 在OV患者中建立并验证基于mRLs的预后特征
首先从TCGA-OV数据集中提取lncRNAs的表达，并通过Pearson相关性分析确定了419个mRLs与m6A调控因子的关系。图1b显示了m6A调控因子和mRLs之间的关系网络。在收集了GSE9891数据集中lncRNAs的表达后，发现有61个mRLs在两个数据集中共同存在。通过TCGA-train的单变量回归分析，筛选出5个与预后有关的mRLs。
图1 TCGA数据集中m6A调节因子和lncRNAs的共表达网络图
将374名OV患者按1：1的比例随机分为训练集和测试集，在训练集中进行LASSO和多变量回归分析，以建立可靠的预后特征。公式如下：风险评分=（-0.068088177 * expr（WAC-AS1））+（-0.276777737 * expr（LINC00997））+ (0.09155959 * expr (DNM3OS)) + (-0.137781856 * (FOXN3-AS1))，expr指表达值。WAC-AS1、LINC00997、DNM3OS和FOXN3-AS1最终被确定为关键的mRLs。GEPIA数据集的表达分析结果和qRT-PCR结果都表明，DNM3OS和FOXN3-AS1在正常组织中的表达量高于肿瘤组织。
作者评估了TCGA训练集中OV患者的风险评分，并将其分为两组。图2显示了TCGA训练集中风险评分的分布、每个样本的生存状态（图2a）和关键基因表达模式的热图（图2e）。与低风险组相比，高风险组患者的生存预后很差（图2i）。基于签名的时间依赖性接收操作特征曲线（ROC）分析显示，1年、2年和3年生存率的AUC分别为0.624、0.694和0.630（图2m）。为了验证mRL预后特征，计算了TCGA-测试集（N = 187）、TCGA-整体（N = 374）和GEO数据集（N = 278）中患者的风险得分，并根据TCGA-训练集的中位风险得分将患者分组（图2b-d）。除DNM3OS外，WAC-AS1、LINC0099和FOXN3-AS1的表达在低风险组中更高（图2-h）。对TCGA测试集、TCGA整体和GEO数据集的Kaplan-Meier分析显示了同样的趋势，即低风险的OV患者的OS高于高风险组（图2j-l）。此外，随时间变化的ROC曲线强调了基于mRLs的预后特征的能力。图2n-p显示了三组中1年、2年和3年生存率的AUC。这些结果都证明了mRL预后特征在OV预测中的准确性和可靠性。
图2 mRL预后特征的构建和验证
02 - 模型与临床因素之间的关系
图S4a-f中进行了风险评分与临床特征之间的关联。年龄≤60岁组的风险评分低于年龄>60岁组（图S4d），高风险评分的老年患者比例为52%，而低风险评分的人群为40%（图S4a）。然而，按肿瘤等级和肿瘤分期分配的组别中，风险评分的差异并不显著（图S4b-c,e-f）。此外，高免疫分值组的风险得分明显高于低分值患者（图S4g），在群组1和群组2亚组的风险评分中也可发现明显差异（图S4h）。按患者年龄、肿瘤等级和肿瘤分期分组的分层分析突出表明，高危组患者的OS比低危组差（图S4i-n）。在比较各组患者的状态时，还发现高危组患者的死亡率较高，而且死亡患者的风险评分在统计学上高于活着的患者。接受化疗的患者OS的K-M曲线显示，高风险的患者比低风险的患者预后更差。在BRCA1患者中，低风险组也有良好的生存结果。
图S4 与TCGA训练集中的临床病理特征相关的风险分数
在TCGA-train、TCGA-test、TCGA-entire和GEO数据集中进行的单变量和多变量回归分析均表明mRL模型的独立性。此外，患者年龄和肿瘤分期也是OV的关键不良预后因素。为了预测签名的性能，作者在TCGA（图3a）和GEO数据集中建立了一个包括风险分数、年龄、等级和阶段的nomogram。图3b-d显示，OS的预测率与观察到的比率高度一致。此外，与其他临床特征相比，预后特征显示出卓越的预测能力，当与临床特征相结合时，该模型显示出比单独使用特征时更好的预测能力（图3e）。
图3 TCGA数据集中OV患者的nomogram
03 - mRL预后特征和TME之间的关联性
GSEA表明，与免疫有关的通路在高危人群中富集（图4a，b）。首先，作者使用ESTIMATE算法，表明高危人群的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分都比较高，而且风险评分与它们有正相关（图4c-h）。在GEO数据集中也发现了同样的趋势（图4i-n）。
图4 在TCGA数据集中，风险分数和免疫特征之间的关联性
然后，通过比较各组之间的22个肿瘤浸润免疫细胞（TIICs），作者发现在TCGA数据集中，静止的树突状细胞和M2巨噬细胞与风险评分呈正相关，T滤泡辅助细胞和调节性T细胞（Tregs）的浸润水平与风险评分呈负相关（图5a-i）。在GEO数据集中，风险评分与γδT细胞和静止记忆CD4 T细胞呈正相关，而风险评分与Tregs、静止NK细胞和活化树突状细胞呈负相关。各组之间免疫评分和TIICs丰度的差异表明，高风险患者具有压抑的免疫表型，这可以部分解释高风险评分者的OS较差。
图5 TCGA数据集中风险评分和免疫细胞浸润之间的关系以及mRLs在肿瘤微环境中的作用
为了确定四个mRLs的免疫学作用，用CIBERSORT算法评估了它们与TIICs的关联。发现DNM3OS与T滤泡辅助细胞、M2巨噬细胞和记忆B细胞有明显的关联；WAC-AS1与T滤泡辅助细胞和M2巨噬细胞有关联（图S8a）。此外，WAC-AS1和LINC00997与免疫评分呈负相关，而DNM3OS和FOXNS-AS1与免疫评分正相关（图S8b）。接下来，为了探索lncRNAs在肿瘤进展中的潜在机制，作者使用GSEA分析来建立OV中mRLs的富集途径（图S8c-f）。发现DNM3OS在钙信号通路、焦点粘附通路、造血细胞系通路、神经活性配体-受体相互作用通路和癌症通路中高度富集。
图S8 m6A相关lncRNAs的表达与免疫特征的关系
肿瘤组织中PD-L2的表达水平高于正常组织（图6a），而且在TCGA和GEO数据集中，高风险评分患者的表达水平明显更高（图6c-f），这表明高风险组从免疫检查点抑制剂（ICIs）中获益较少。此外，LINC00997显示出与PD-L2高度相关（图6b）；因此，LINC00997在肿瘤免疫微环境中的功能值得进一步研究。比较各组之间的免疫表型（IPSs），低风险组的IPSs明显较高，表明其免疫原性表型更强（图6g-j）。这些结果都表明，该签名可以预测OV患者的免疫疗法的疗效。
图6 IPSs和免疫疗法的基因表达分析
04 - 与OV预后和TME相关的mRLs的共识聚类
经过共识聚类，TCGA数据集中的OV患者根据重要的预后mRLs的表达情况被划分为群组1和群组2（图7a-d）。图7e中进行了群组1和群组2之间表达模式的热图。此外，群组2中的基质、免疫和ESTIMATE评分明显较高，肿瘤纯度大幅降低（图7g-j）。此外，群组1亚组的幼稚B细胞、T细胞激活记忆CD4细胞、T滤泡辅助细胞、M1巨噬细胞和静止肥大细胞的浸润更高，而M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞在群组2亚组中较高（图7f）；因此，群组2更倾向于表现为免疫抑制表型。Kaplan-Meier分析的结果强调，群组2的OS明显比群组1差（图7k），而且群组2的PD-L2表达量更高（图7l）；这表明群组2的患者可能对免疫治疗反应更敏感。上述结果都表明，mRLs的表达影响着TME，导致不同的预后。
图7 OV共识聚类亚群的预后和免疫浸润情况
05 - 泛癌中lncRNAs的表达和免疫状态
作者利用TCGA的33种癌症的泛癌数据，进一步研究四种mRLs与泛癌中的免疫特征、干细胞特性和患者预后之间的关系。33种癌症中lncRNAs的表达模式（图8a-d）显示了肿瘤间的异质性，但在大多数癌症中，WAC-AS1的表达水平在肿瘤组织中较高，而DNM3OS的表达水平则相反，这与OV的表达趋势一致。四种mRLs在所有33种癌症类型中的表达分布与上述结果呈现相同的趋势（图8e）。此外，关键mRLs之间没有明显的相关性。Kaplan-Meier分析和单变量回归分析显示，mRLs在不同癌症患者的生存中的作用各不相同。
图8 泛癌症mRLs的表达
为了确定泛癌中关键mRLs和免疫特征之间的关系，作者调查了免疫亚型以及与基质评分、免疫评分、基于DNA甲基化的干性评分（DNAss）和基于mRNA的干性评分（RNAss）的相关情况。通过对泛癌的广泛免疫基因组分析，根据免疫、遗传和临床特征的差异，确定了六种免疫亚型，包括伤口愈合型（C1）、IFN-γ主导型（C2）、炎症型（C3）、淋巴细胞耗竭型（C4）、免疫安静型（C5）和TGF-β主导型（C6），其中C3的OS很好，C2和C1的预后差，而C4和C6的预后最差。作者评估了mRL表达水平与六种免疫亚型之间的相关性，发现它们都与泛癌免疫亚型有关，并且C1、C2和C6亚型的DNM3OS表达量升高（图9a）。此外，DNM3OS与基质评分和免疫评分呈正相关，而WAC-AS1和LINC00997与基质和免疫评分呈负相关（图9b-d），这在OV中表现出类似的相关性。所有四个mRLs都与RNAss呈负相关（图9e）。因此，这四个mRLs参与了特定TIME的形成。最后，应用CellMiner数据库来评估mRLs和药物敏感性之间的相关性。z-score越高意味着对一种特定药物的敏感性越高。显著的是，FOXNS-AS1的表达影响了各种细胞系的药物敏感性。
图9 泛癌症中mRLs的表达与免疫亚型、肿瘤微环境和癌症干性的关系
四、结论
总之，本研究建立了一个独立而可靠的mRLs预测特征，并系统地评估了其预测的准确性和在TIME中的作用。共识聚类分析和泛癌分析证明了特定的mRLs在不同癌症类型中的重要作用，这可能有助于发现OV的新型治疗靶点。
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