SDS-PAGE原理

SDS-PAGE是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。其中四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂能催化过硫酸铵产生自由基。过硫酸铵（APS）作为催化剂产生自由基，从而引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

其中SDS（十二烷基硫酸钠）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS作用原理

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。之所以会有分离胶和浓缩胶之分，浓缩胶和分离胶的PH值不同，前者主要表现为浓缩效用，后者表现为分子筛效用。浓缩胶的pH是6.8，在这个pH条件下，缓冲液中的HCl的Cl离子几乎全部解离，Gly的等电点为6.0，仅少数解离为负离子，在电场中移动速度很慢。酸性蛋白质在此pH下解离为负离子，三类离子的迁移速率为Cl>一般蛋白质>Gly，电泳开始后，Cl离子泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。Gly在电场中移动很慢，造成移动离子的缺乏，于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区，在高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl离子区域时，高电压消失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，按照电荷大小排列，但是由于目标蛋白都带有负电荷，所以位于同一的起点。从浓缩胶进入分离胶后，胶的pH升高，Gly的离解度增大，泳动率上升，又因为它分子小，故超过所有的蛋白质分子，紧跟在Cl离子后，Cl离子迁移后，低离子浓度不再存在，形成了恒定的电场强度，因此，蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质，分子大小和形状，分离胶的孔径有一定大小，对不同相对质量的蛋白质来说，通过时收到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。

胶配置的方法

步骤：

1.配胶，有分离胶和浓缩胶之分，胶浓度随你蛋白的大小变化而变化，一般12%，一般需要两个小时，需要提前准备。短期可以充水放置于4℃冰箱。

2.将蛋白加入5X的SDS-loading， 100℃加热10min，以充分变性蛋白。

3.上样，一般10μL。

4.浓缩胶一般80V 30min 进入分离胶后可140V 30min。

5.结束后可用于考染或者western blot。

配胶小方法

最后的最后  提醒一下自己：

丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺（Arc-Bis）：中等毒性，神经毒剂。低浓度接触数月数年后，渐出现头痛头晕疲劳，嗜睡，手指剌痛，麻木感，常伴有两手掌发红，脱屑，手掌足心多汗。

过硫酸铵（APS）：对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性.吸入后引起鼻炎、喉炎、气短和咳嗽等.眼、皮肤接触可引起强烈刺激、疼痛甚至灼伤.口服引起腹痛、恶心和呕吐.长期皮肤接触可引起变应性皮炎.。

SDS：对粘膜和上呼吸道有刺激作用,对眼和皮肤有刺激作用.可引起呼吸系统过敏性反应。

TEMED：强神经毒剂

记得带上手套和口罩！