microRNA茎环引物设计

miRNA是一类内源性非编码单链RNA，在体内以前体和成熟体的形式存在，而我们对某种的microRNA的表达检测的对象是成熟体，microRNA的成熟体长度约为19-25nt，由于其序列和性质的特殊性，我们需要使用与普通mRNA不同的方法对其进行引物的设计。目前主流的方法有两种：茎环法和加尾法

图片.png
基本的原理图示如上，因为microRNA很短，引物为了方便接下来的检测我们可以通过具有颈环样结构的反转引物先将microRNA进行逆转录，然后再将用于表达检测的3‘引物（即图中reverse）设计在反转引物上，最后结合mircoRNA的5‘序列设计一个5’端的定量PCR引物（图中Forward）即可。
在笔者入行之初，就是按照对原理理解，然后手动一个个打出碱基序列来设计引物的。此外，上游引物虽然多为miRNA序列，还需要根据实际情况在5'端添加碱基数目以配合CT值，所以手动自然不是长久之道。
虽然可以用PRIME设计反转引物，对于配对的上游检测引物也需要单独设计，偶然看到诺唯赞公司官网提供的Vazyme miRNA引物设计软件，真是如鱼得水，反转、定量引物一步到位，强烈推荐。

下面是给出的安装教程指南：

1. 在安装软件miRNA Design时，如果出现“Component 'RICHTX32.OCX' or one of its dependencies not correctly registered:a file is missing or invalid”错误(见下图)，说明系统文件Richtx32.ocx丢失或无效，导致无法注册，首先注册文件，该方法如下：

图片.png

2. 查看系统类型。鼠标移至计算机，右键，选择属性，在弹出的窗口中查看系统类型(见下图)。

   
   图片.png

3. 如果是32位系统，将Richtx32.ocx（在文件夹里面）复制到C:\Windows\System32目录下;
   如果是64位系统，Richtx32.ocx文件复制到C:\Windows\SysWow64

4. 用管理员身份进入cmd窗口。程序---附件---命令提示符（管理员身份进入）(见下图)
   Windows10系统打开管理员命令提示符
   

   图片.png

5. 输入命令。

32位系统，输入”regsvr32 richtx32.ocx";
64位系统，输入“cd c:\windows\SysWow64",回车，最后输入"regsvr32 richtx32.ocx"。

图片.png

6. 确认操作。成功注册系统会弹出："注册成功"提示框。(见下图)

   
   图片.png

7. 再去打开miRNA Design，即可。

   
   图片.png
   

   输入序列必须是成熟体miRNA序列，即胸腺嘧啶为尿嘧啶。
   例如miR-8-3 TAATACTGTCAGGTAAAGATGTC,可在word内将T全部替换为U，
   得到UAAUACUGUCAGGUAAAGAUGUC，然后粘贴即可。