成熟miRNA长度在20bp左右，realtime合适的检测长度在80~150bp，因此需要在原有序列中增加茎环结构，以延长miRNA.
- 实验步骤：提取总RNA，反转录成cDNA（在这一步中加入RT引物），以cDNA为模板检测
- 举例：
sbi-miR6220-5p
CUCCAUCCUAAAUUAUAAGACAUU
1. 用于延长miRNA的RT-primer：
茎环序列+成熟miRNA序列末尾的8个碱基的反向互补序列：
我常用的茎环序列：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA
末尾八个碱基反向互补：
AAGACAUU--->aatgtctt
RT-primer：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAaatgtctt
2. realtime上游引物
方法一：手动设计（下段为引用）
上游引物包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。
即：上游引物为5‘- 通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ，自miRNA5’端抄起，14-16个或13-14个。
通俗的说就是：保护性碱基（用来调GC含量的）+miRNA 5 端的13-16个碱基（不要抄到最后那6-8个上去了，意思就是不要与RT那段重叠了）
补充：保护碱基很多种，不加也可，与RT那段重叠不要太多就行。方法虽然简答，但是算GC也麻烦，推荐方法二。
方法二：
参考：https://blog.sciencenet.cn/blog-3372875-1090322.html
下载miRprimer，做完第一步就够了，选择结果文件中排名第一的F引物。
3. realtime下游引物
根据茎环序列设计，一起做的几个miRNA可以通用，严谨的话可以根据上一步的F引物算一下GC比，在茎环上选一段。
stem-R
5' CAGTGCAGGGTCCGAGGTA 3'
网友评论