发育轨迹分析是单细胞分析中比较常见的一种分析，旨在预测出细胞类型之间的发育关系，构建细胞的发育轨迹。常见的发育轨迹分析有很多，例如monocle2/3，RNA velocity等。今天小编就来简单介绍一下我们在日常分析中的RNA velocity流程。大家如果想了解RNA velocity的原理，也可以参考一些网上的文章（RNA velocity of single cells文献学习）

话不多说，我们直接进入正题吧~

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1. 软件安装

<pre data-tool="mdnice编辑器" style="margin: 10px 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: rgb(0, 0, 0); font-size: 16px; font-style: normal; font-variant-ligatures: normal; font-variant-caps: normal; font-weight: 400; letter-spacing: normal; orphans: 2; text-align: left; text-indent: 0px; text-transform: none; widows: 2; word-spacing: 0px; -webkit-text-stroke-width: 0px; background-color: rgb(255, 255, 255); text-decoration-thickness: initial; text-decoration-style: initial; text-decoration-color: initial; border-radius: 5px; box-shadow: rgba(0, 0, 0, 0.55) 0px 2px 10px;">`# 在安装之前需要安装以下依赖包：
conda install numpy scipy cython numba matplotlib scikit-learn h5py click
pip install pysam

安装velocyto

velocyto依赖python3，但是我目前都是python2，所以需要安装python3

conda install -c bioconda velocyto.py` </pre>

conda安装velocyto的命令是怎么找到的，请参考conda安装软件指南，或者参考velocyto官网安装指南

但是在安装的过程中总出现以下的报错信息： 图片 主要是环境配置不成功，使用到的python是2.17版本，但是我查到python版本时候，又确定是3.9版本的 图片 图片

随后我又查了一些资料：conda中python环境的配置，发现安装软件的时候可以在命令后添加python=2/3，用这种方式来调用python的版本，随后我也这样尝试了一下，果不其然，这样操作以后就可以正常安装了~

conda install -c bioconda velocyto.py python=3

图片

检查软件是否安装成功which velocyto

图片

2. 运行流程

2.1 文件格式转换（bam to loom）

<pre data-tool="mdnice编辑器" style="margin: 10px 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: rgb(0, 0, 0); font-size: 16px; font-style: normal; font-variant-ligatures: normal; font-variant-caps: normal; font-weight: 400; letter-spacing: normal; orphans: 2; text-align: left; text-indent: 0px; text-transform: none; widows: 2; word-spacing: 0px; -webkit-text-stroke-width: 0px; background-color: rgb(255, 255, 255); text-decoration-thickness: initial; text-decoration-style: initial; text-decoration-color: initial; border-radius: 5px; box-shadow: rgba(0, 0, 0, 0.55) 0px 2px 10px;">`velocyto run -u Gene -o ./ -e KO -v /XXX/06.RNA_velosity/input/i1.KO.bam /XXX/Database/refdata-gex-mm10-2020-A/genes/genes.gtf

参数信息

-u 用于保证UMI的唯一性，如果设置为Gene，则将GX 标签将附加到UB 标签
-o 结果目录，./表示在讲结果保存到当前目录
-e 设置的样本名称，将在loom文件中对每个记录添加上该信息，尽量短一些
-v 是否显示详细信息，-v (only warnings) -vv (warnings and info) -vvv (warnings, info and debug)
默认数据bam文件和gtf文件

如果想了解更多参数的信息，可以输出"velocyto run --help"进行查看` </pre>

2.2 合并loom文件（可选）

当多个样本在一起做分群的时候，需要执行这一步，如果是单个样本的RNA velocity则不需要进行loom文件的合并。

合并方法很简单，需要准备两个文件（1.python脚本；2.所需loom文件的路径），然后运行一个python脚本即可。

Tips：需要注意的是velocyto依赖python3，所以需要调用python3所在的路径

1. python脚本（merge.py）内容如下：

<pre data-tool="mdnice编辑器" style="margin: 10px 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: rgb(0, 0, 0); font-size: 16px; font-style: normal; font-variant-ligatures: normal; font-variant-caps: normal; font-weight: 400; letter-spacing: normal; orphans: 2; text-align: left; text-indent: 0px; text-transform: none; widows: 2; word-spacing: 0px; -webkit-text-stroke-width: 0px; background-color: rgb(255, 255, 255); text-decoration-thickness: initial; text-decoration-style: initial; text-decoration-color: initial; border-radius: 5px; box-shadow: rgba(0, 0, 0, 0.55) 0px 2px 10px;">`import loompy

files = []

inf = open("loom.file.list", "r")
for line in inf:
files.append(line.strip())
inf.close()

loompy.combine(files, "merged.loom", key="Accession")` </pre>

2. 所需loom文件的路径所需loom文件的路径都存放在loom.file.list文件中（如下图，每一行是一个loom文件的绝对路径）

图片

最后把这两个文件放在用一个目录下运行即可：

<pre data-tool="mdnice编辑器" style="margin: 10px 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: rgb(0, 0, 0); font-size: 16px; font-style: normal; font-variant-ligatures: normal; font-variant-caps: normal; font-weight: 400; letter-spacing: normal; orphans: 2; text-align: left; text-indent: 0px; text-transform: none; widows: 2; word-spacing: 0px; -webkit-text-stroke-width: 0px; background-color: rgb(255, 255, 255); text-decoration-thickness: initial; text-decoration-style: initial; text-decoration-color: initial; border-radius: 5px; box-shadow: rgba(0, 0, 0, 0.55) 0px 2px 10px;">/xxx/python merge.py </pre>

运行完成后就可以得到名为merged.loom的loom文件

图片

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运行完这两步以后，我们的准备文件就都得到啦。我们下期在具体讲讲在R中运行RNA velocity的流程~