期刊：Frontiers in Immunology
影响因子：5.7
本文的思路是通过单细胞数据分析识别了某种免疫细胞特有的marker基因，然后利用这些基因进行预后模型的构建。
研究概述
自然杀伤细胞（NK）在介导乳腺癌（BRCA）的抗癌活性中起着重要作用，但NK细胞相关分子在预测BRCA结果和指导个性化治疗方面的潜力尚未得到探索。本研究发现肿瘤浸润性NK细胞是BRCA的有利预后因素。利用单细胞测序和转录组学数据，通过WGCNA鉴定出与免疫治疗耐药相关的模块基因，采用交叉和Lasso回归确定了7个NK相关预后特征，并开发了NK相关风险评分系统（NKRS）。通过多个队列的生存和临床相关性分析验证了该评分系统的可靠性。研究发现，NKRS在TME景观、免疫功能、免疫治疗反应和化疗敏感性等方面表现出强大的预测能力。此外，发现NKRS组成基因KLRB1和CCND2是关键预后基因，并通过ST和IHC证实了它们与BRCA样本中NK细胞的表达相关性。
肿瘤浸润NK细胞丰度较高的BRCA患者具有更好的预后结局
为了确认BRCA中NK细胞预后意义，作者使用MCPcounter算法来估计大量RNA-seq样本中肿瘤浸润NK细胞的丰度，生存曲线分析显示，高NK组和低NK组间存在着显著差异，其中高NK组表现出更长的生存期（图2A），表明NK细胞对BRCA具有良好的预后影响。这一现象在METABRIC队列中也观察到相同的趋势（图2B）。作者利用在线单细胞数据库进行肿瘤内的细胞分群（图2C-D），展示了NK细胞典型标记基因的表达（图2E-G），并筛选出534个NK相关基因（NKRG）（图2H）。
基于转录组学的WGCNA筛选与ICB耐药相关的模块基因
由于NK细胞可以直接调节抗肿瘤免疫，作者通过使用GSVA将ICB耐药评分分配给TCGA-BRCA队列中的样本（图3A），进行WGCNA分析与获取ICB相关的基因模块（图3B-E）。黑色模块与ICB的相关性最强（图3F），通过将黑色模块基因与NKRG取交集，共获得了373个与ICB抗性相关的NKRG（图3G）。
开发由七个预后NKRG组成的NK相关特征
为了提高特征的预后准确性，作者在TCGA-BRCA队列中通过单变量Cox回归鉴定了1612个预后基因。将预后基因、NKRG、黑色模块基因取交集后，将基因范围缩小至49个（图4A）。通过LASSO回归分析，选择了7个关键预后NKRG用于建造风险评分模型（图4B-C），每个特征基因的风险比如图4D所示。根据风险评分模型所预测的风险评分（NKRG）临界值，对BCRA样本进行分组，低NKRS组表现出延长的总生存期（OS）、无病生存期（DFS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展生存期（PFS）（图4I-N）。
在多个队列中确定NKRS的独立预后作用
为了探讨NKRD是否可以作为BRCA的独立预后因素，作者进行了单变量和多变量COX回归分析，发现NKRS对BRCA的进展不会随着其他临床因素而变化，这表明其具有独立预后的功能（图5A、B）。在验证队列中也进一步证实这一点（图5C-D）。TimeROC曲线表明，NKRS在TCGA-BRCA和验证队列中都具有较好的准确性（AUC>0.6,图5E-F）。整合独立预后指标，作者创建了以分期，年龄和NKRS组成的预测列线图（图5G）。此外，直方图和箱线图显示，高NKRS组在60岁以上且容易死亡的患者中更为普遍（图 5H、I）。正如预期的那样，在高 NKRS 组中发现转移性癌症患者比例更高（图5J）。上述结果表明，NKRS不仅与BRCA患者的生存率相关，而且与肿瘤大小和转移等临床病理参数具有良好的相关性，使其成为一个有前途的预后指标。另外作者还通过GESA富集分析评估了高低NKRS评分组中免疫通路的差别（图6），暗示低NKRS组患者的预后改善可能是由于免疫反应和肿瘤微环境（TME）引起的。
基于NKRS分组后的免疫微环境差异
免疫浸润结果表明，低 NKRS 组中 CD4 +T细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的比例较高（图7A、B）。此外，低NKRS 组还表现出显着较少的浸润性M0和M2巨噬细胞、中性粒细胞和更多的M1巨噬细胞（图 7B）。此外，ImmunecellAI 和 CIBERSORT 算法一致证明 NKRS与CD8 +细胞和NK细胞之间存在很强的相关性（图7A、B）。小提琴图显示，低NKRS组拥有较高的基质、免疫和ESTIMATE评分，表明NKRS与各种TIC的丰度呈负相关（图7C、D）。此外，高NKRS组表现出更高的肿瘤纯度，进一步证实了NKRS与 TME评分之间的关系（图7E、F）。上述结果表明，低NKRS组TME中抗肿瘤免疫细胞成分水平显著升高。另外，作者还生成了热图以研究组成NKRS的七个特征基因与TME之间的关联（图7G-H）。
低NKRS患者表现出增强的抗肿瘤免疫力和ICB敏感性增加
作者发现与免疫功能相关的基因，抗原加工和呈递相关基因以及免疫检查点基因在不同评分组间表现出显著差异表达（图8A-C），如常见的免疫检查点PD-L1、PDCD1、CTLA4、LAG-3和CD86在低NKRS组中出现上调。低NKRS肿瘤在癌症免疫周期通路中表现出显着较高的分数（图8D）。此外，干扰素、细胞因子和NK细胞介导的细胞毒性活性在低NKRS组中也上调，进一步说明NKRS与抗癌免疫之间存在很强的负相关。TIDE 算法结果表明，低 NKRS 组的 CD8+ T细胞和IFN-γ的特征评分较高，相反，主要参与限制抗肿瘤免疫的M 巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSC）在高 NKRS组中得分更高（图8E）。高NKRS组也具有较高的TIDE评分，表明高 NKRS 患者的潜在ICB疗效较差。在免疫表型评分（IPS）方面，无论PD-1或CTLA-4的表达模式如何，低NKRS组都有更高的IPS评分（图8F）。在免疫治疗反应方面，低NKRS组对ICB治疗有反应的参与者比例高达22%（123/562），而高 NKRS 组没有反应者（0%，0/458），强烈支持NKRS具有预测免疫治疗反应的能力这一观点（图 8G）。几个接受ICB治疗的真实世界患者队列也进一步证实随着 NKRS的减少，肿瘤生长变得更加可控，导致更长的PFS和OS（图8H-I）。
低NKRS患者具有更好的化疗结果
9A-K表明高 NKRS 个体对大多数化疗药物的反应较差, 通过分析两个NKRS组的转录差异，并将其提交给Cmap数据库，作者获得了对高NKRS组病例进行治疗干预的潜在药物，分别是Pilaralisib、Tivozanib、Lapatinib 和 Axitinib，它们的化学结果如图9Q-T所示。
随机森林结合实验验证
为了进一步筛选出模型中具有靶向价值的重要 NKRGs，作者采用了机器学习的方法，并使用随机森林算法筛选了关键的NKRG。在分析 TCGA-BRCA数据集后，KLRB1和CCND2被确定为重要的NKRG，因为它们对患者预后最重要（图10A、B）。作者在两个外部队列中也得到了一致的发现（图10C-F）。此外，ROC 曲线显示这7种NKRG的性能可靠，KLRB1和CCND2的AUC分别为0.720和0.904，代表高可靠性（图10G）。在TCGA-BRCA队列和多个验证队列中，KLRB1或CCND2的较高表达能够预测BRCA患者更长的OS（图10H-K）。上述结果明确表明，KLRB1和CCND2是BRCA中关键的预后NKRG。最后作者通过结合空间转录组学和基于BRCA组织标本的IHC，验证了关键NKRGs、KLRB1和CCND2与肿瘤浸润NK细胞之间的关联。BRCA的两个公开可用的空间转录组切片显示KLRB1和CCND2的空间表达与NK细胞标志物NKG7之间存在很强的正相关（图11A、B）。使用BRCA组织微阵列的进一步IHC染色显示，KLRB1和CCND2均显示出与 NK细胞的典型标志物CD56的空间共定位（图11C）。
这篇文章的数据形式很丰富，实操性也很强。作者聚焦于NK细胞，一方面从单细胞数据中筛选NK细胞相关的基因(NKRG)，另一方面利用RNA-seq数据筛选与ICB耐药相关的基因， 将两方面得到的基因取交集，筛选到与ICB抗性相关NKRG。随后作者通过单因素变量cox回归和lasso 进一步筛选和建立了由七个基因组成的NKRG相关预后模型，该模型可以准确将病人划分为高NKRS和低NKRS评分两组，其中低NKRS组与患者的较好预后存在正相关，展现出良好的临床病理相关性。另外，作者还评估了NKRS不同组所介导的免疫通路，肿瘤微环境，抗肿瘤免疫能力和敏感性以及化疗结果的差异。最后作者通过机器学习再次筛选模型组成基因中的关键基因，并通过空间转录组学和IHC验证关键基因与NK细胞之间的关系。该研究为BRCA患者的预后评估和个体化治疗提供了一种基于NK细胞的新视角。
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