Integrated pharmaco-proteogenomics defines two subgroups in isocitrate dehydrogenase wild-type glioblastoma with prognostic and therapeutic opportunities

整合的药物蛋白质组学定义了异柠檬酸脱氢酶野生型胶质母细胞瘤中的两个亚型，具有预后和治疗机会

期刊：Nat Commun；影响因子：12.121

发表单位：延世大学医学院等

导 读

    多形胶质母细胞瘤（GBM）是成人脑癌的致死形式，目前可用的治疗程序，包括完全切除、放疗和化疗或与DNA烷基化替莫唑胺的组合在很大程度上是无效的。许多研究已经基于基因组、转录组和表观遗传学等水平试图确定主要致癌事件和治疗干预可操作点，尽管做出了努力，但这些基于突变和基于转录组的方法在临床上的应用仍然有限，建立预测性生物标志物或患者分层策略以用于开发靶向疗法仍是挑战。基于蛋白质组的患者分层可能会提供一种更有效的方法来预测目标药物的预后和易感性，尽管一些研究已经进行了脑胶质瘤组织样本的蛋白质组学分析，但尚未报道GBM的大规模蛋白质组学表征。

    2020年7月发表在《Nature Communications》的一项研究中，对50个神经胶质瘤组织进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学检测，同时整合了基因组、转录组学和临床信息。整合药物-蛋白质组学方法深入了解了GBM起源细胞中的肿瘤间和肿瘤内异质性、致癌信号传导和代谢途径，突出了IDH野生型GBM患者的潜在有效预后和治疗策略。

摘 要

    由于肿瘤的高分子异质性，目前对最具侵袭性的异柠檬酸脱氢酶1/2（IDH）野生型胶质母细胞瘤（GBM）分子亚型的预后和治疗相关性受到限制。本研究描述了IDH野生型GBM肿瘤的独特二元分类，它来自39种IDH野生型GBM以及IDH突变和低级神经胶质瘤对照的定量蛋白质组分析。具体来说，GBM蛋白质组1（GPC1）肿瘤表现出Warburg样特征，神经干细胞标记、免疫检查点配体和预后不良的生物标记FKBP脯氨酰异构酶9（FKBP9）。同时，GPC2肿瘤显示出升高的与氧化磷酸化相关的蛋白质，分化的少突胶质细胞和星形胶质细胞标志物，以及良好的预后生物标志物磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）。将这些蛋白质组学特征与匹配的患者来源细胞（PDC）的药理学特征相结合，发现mTORC1/2双重抑制剂AZD2014对预后不良的PDC具有细胞毒性。分析结果将为GBM的预后和精确治疗提供指导策略。

研究概要

1    蛋白质组学数据代表神经胶质瘤疾病状态

    作者收集了39个IDH野生型GBM、2个IDH突变型GBM和9个低度神经胶质瘤（LGG）样本。外显子组测序（WES）和RNA测序（RNA-seq）数据已显示主要驱动基因突变的广泛覆盖，并确定了4种RNA分子谱亚型。通过蛋白质组学和磷酸化组学定量分析，鉴定了9367个蛋白质和8020个氨基酸位点的磷酸化。除了某些持家功能的基因，包括核糖体和氧化磷酸化相关的基因外，蛋白表达水平一般与RNA水平呈正相关。通过对蛋白质组数据进行无监督的层次聚类，结果与RNA亚型和临床表型密切相关，而与DNA水平的相似性无关，表明蛋白质组可能比基因组更好地代表疾病状态和基础生物学。差异蛋白组分析显示，神经胶质瘤中参与细胞增殖和免疫反应的蛋白质水平升高。IDH野生型神经胶质瘤的预后显著低于IDH突变型，并与25个磷酸位点的磷酸化水平升高显著相关。总之，定量蛋白质组学数据可以通过临床表型准确地将神经胶质瘤样品聚类，并确定激活的途径及其调节剂。

图1，蛋白质组学表征揭示了GBM患者的分子异质性。b，胶质瘤组织的定量蛋白质组学分析概述；e，使用蛋白质组学数据对50个样本进行无监督分层聚类。

2    IDH野生型GBM的两个蛋白质组亚型

    通过对蛋白质组学数据的共识性聚类，作者确定了IDH野生型GBM的两种稳定的蛋白质组学亚型，称为GPC1和GPC2。两种GPC亚型很大程度上独立于四种RNA亚型。GPC1全局蛋白质组表达模式与正常脑组织不同，而GPC2全局蛋白质组表达则显示正常的脑组织样模式。基于变异等位基因频率（VAF）分布，GPC2肿瘤的纯度与GPC1的纯度没有显著差异，表明肿瘤中正常细胞的丰富并不有助于这些蛋白质组学差异。在复发性肿瘤中观察到亚型转换，很可能是由治疗引起的。EGFRvIII和PIK3CA突变仅在GPC1肿瘤中发现，而TP53、NF1、PTEN、RB1和EGFR中的其他GBM驱动程序突变则相对均匀地分布在两个亚型之间。

图2，IDH野生型GBM的蛋白质组学亚型与临床和基因组特征有关。 a，基蛋白质组数据的IDH野生型GBM样本的共识聚类；b蛋白质组学亚型的特征，热图表示蛋白质表达水平，箱线图表示变异等位基因频率（VAF）；d，与蛋白质组亚型相关的GBM驱动程序突变。

3    OXPHOS相关蛋白决定了蛋白质组学亚型

    蛋白质组数据的主成分分析（PCA）显示两种GPC亚型的明显区分。对PC1高负荷蛋白质的分析显示，OXPHOS中涉及的蛋白质显著富集且在GPC1中的表达明显低于GPC2，而亚型之间的OXPHOS mRNA水平没有差异。与正常细胞相比，GPC2肿瘤表达参与糖酵解、丝氨酸生物合成、三羧酸（TCA）循环、谷氨酰胺分解和OXPHOS的蛋白质水平相似，但水平明显高于GPC1肿瘤中的蛋白质水平，表明GPC2肿瘤主要通过OXPHOS产生ATP。与GPC2肿瘤相比，GPC1肿瘤表达更高水平的乳酸脱氢酶A（LDHA）和参与葡萄糖摄取、己糖激酶2（HK2）、戊糖磷酸途径（PPP）和一碳途径的蛋白质，表明GPC1肿瘤在代谢上依赖于Warburg效应。

图3，参与中心碳代谢的蛋白质是IDH野生型GBM蛋白组亚型的主要决定因素。c，两种蛋白质亚型之间参与中央碳代谢的差异表达蛋白的途径视图，星号表示两种GPC亚型之间蛋白质表达的统计学差异，没有可用蛋白质表达数据的基因以灰色显示，GPC1和GPC2肿瘤中升高的途径总结为右图中的彩色箭头。

4    PHGDH预测IDH野生型GBM的预后良好

    作者分析了GPC1和GPC2亚型的脑细胞起源，发现GPC1肿瘤源于神经干细胞，而GPC2肿瘤可能源于少突胶质细胞和星形胶质细胞。先前的研究确定了GBM预后基因表达生物标志物，包括66个有利基因和205个不利基因。作者在蛋白质水平进行验证，GBM队列的单变量Cox回归分析确定了两个对IDH野生型GBM有利的生物标记，磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）和Raftlin家族成员2（RFTN2），以及一个不利标记，FKBP脯氨酰异构酶9（FKBP9）。FKBP9在GPC1中升高，而PHGDH和RFTN2在GPC2中更高。三种蛋白质中，PHGDH是与队列 中IDH野生型GBM患者更长生存期相关性最强的生物标志物。

图4，GPC2相关的PHGDH预测IDH野生型GBM的预后良好。a，蛋白质组学亚型之间的神经干细胞（橙色）、少突胶质细胞（蓝色）和星形胶质细胞（紫色）的蛋白质标记物的差异表达，以评估GPC1和GPC2亚型的脑细胞起源；d，三种蛋白生物标志物与患者预后的Kaplan-Meier生存曲线。

5    GPC亚型的空间和细胞类型特征

    GBM在转录水平上具有明显的肿瘤内异质性，单个肿瘤包含具有不同亚型和混杂细胞状态光谱的细胞，暗示优势细胞群可能决定了大块肿瘤的代表性亚型。因此，作者将GBM蛋白质组学亚型分类与前人报道的单细胞转录组数据进行匹配。GPC1亚型的单个细胞中NSC标记CD44和VIM显著升高，而GPC2亚型的少突胶质细胞标记OLIG2、OSP和MOG以及星形胶质细胞标记SLC1A2和S100B升高。周围环境主要决定了正常细胞群体的蛋白质组学亚型，肿瘤核心中84％的正常细胞表现出GPC1特征，而外围70％的正常细胞表现出GPC2特征。由于两个亚型显示出不同的免疫逃避特性，作者进一步研究了每个亚型的肿瘤单个细胞是否可变表达免疫检查点配体，发现PD-1配体PD-L1在GPC1肿瘤的肿瘤细胞中被上调。这些结果表明GBM肿瘤包括属于两种GPC亚型的细胞，并且赘生性细胞亚型的比例影响总体肿瘤特征。此外，肿瘤核心的肿瘤细胞表现出高度可变的GPC亚型，这表明肿瘤细胞的蛋白质组亚型主要由癌症内在因素而非肿瘤微环境决定。

图5，GBM单细胞的分类揭示了GPC亚型的肿瘤层依赖性和细胞类型依赖性特征。a，引用前人报道的数据集对GBM单细胞进行分类；b，替代蛋白质组学亚型的单个细胞的2D t-SNE投影；e，两个亚型的非肿瘤单细胞的比例；f，肿瘤单细胞中免疫检查点配体CD274（PD-L1）的亚型特异性mRNA表达；g，使用PHGDH（黄色）和Nestin（红色）抗体对SMC-TMA样品进行多重荧光免疫组织化学分析的代表性图像。

6    GPC亚型对靶向疗法的敏感性

    作者最后评估了对侵袭性GBM具有选择性的靶向药物。已知的药物靶标与药物反应密切相关，并在蛋白质水平上观察到药物敏感性和靶标通路激活关系。坦度替尼、奥拉帕尼、克唑替尼和AZD2014可能是针对GPC1肿瘤的有希望的靶向治疗，而埃司莫德布和坎尼替尼对于GPC2肿瘤可能更有希望。总而言之，对患者匹配样品中药物蛋白质组学数据的综合分析显示，蛋白质组学亚型相关和蛋白质生物标志物依赖性对靶向药物的敏感性，这可能为将来GBM治疗的患者分层策略提供更多见解。

图6，对靶向疗法的亚型特异性和生物标志物依赖性。a，药物反应与蛋白之间的相关性测试；b，蛋白质（或mRNA）的表达水平与针对靶向它们的所示药理化合物的反应之间的相关性；c，靶向疗法对与蛋白质组相关的患者源性肿瘤细胞的GPC1或GPC2选择性细胞毒性谱；d，c中异GPC1选择性（上）和GPC2选择性（下）药物相关基因组的亚型特异性差异；e，蛋白质的表达水平与对所示药理化合物的反应之间的相关性。

讨 论

    本研究综合药物蛋白质组学分析突出显示了使用蛋白质组学数据来了解GBM细胞起源、致癌信号传导和代谢多样性之间的联系的重要性，所有这些都形成了独特的二元分子亚型。研究数据阐明了与分子亚型状态和生物标记蛋白相关的独特治疗脆弱性，并提出了GBM的潜在有效治疗策略。