（1）
液-液相分离的发生是蛋白质和核酸在某种特定的情况下的一个普遍特性，然而多数相分离根本不可能发生在一个正常的细胞中。
仅有一小部分蛋白质的序列具有在活细胞内形成相分离的能力。
（2）IDR
IDR是相分离蛋白中一种常见的结构域，一级序列往往决定了这些蛋白的相变能力、相变的驱动因素、相变的临界浓度及黏弹性。能够影响相分离的序列特征包括IDR的长度、数量、模式、及IDR与IDR间序列的特征。典型的决定因素包括疏水性氨基酸的组成、模式等。尽管IDR中疏水性氨基酸的含量相对较少，他们代表了相分离中的粘附成分、并根据温度变化调控相分离的浓度。带电氨基酸也能够影响相分离的形成，成对的、带相反电荷的蛋白能够以复合凝聚的形式形成沉淀。
推测蛋白质中的IDR以分析其发生相分离的能力
http://db.phasep.pro/ #文章验证过的蛋白或RNA的相变能力
http://plaac.wi.mit.edu/visualize/b61679f0-d94f-0138-6fac-120ec30afef1 # 预测prion-like啊计算序列（下述讲）
http://www.pondr.com/ #推测蛋白质中的IDR
(3)翻译修饰
另外需要注意的是，蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于相分离是非常重要的，在细菌表达纯化出来的蛋白一般翻译后修饰非常少，在真核细胞纯化的蛋白一般具有较好的翻译后修饰，建议真核表达的蛋白在做实验之前，最好先使用质谱等方式鉴定其翻译后修饰，以保证实验的可重复性以及利于更深入地了解该蛋白发生相分离的具体的分子机制。
（4）体外相分离实验蛋白纯化
在纯化的过程中，一般要避免目的蛋白发生相分离现象，但是如果发生相分离后，可以被一定的条件重新溶解，也可以通过利用这种反复发生相分离，溶解的方法来纯化该蛋白。
纯化出来的蛋白需要用SDS-PAGE以及质谱等方式鉴定是否确实是目的蛋白以及鉴定其纯度。我们建议将蛋白保存在不发生相分离的Buffer中，保存Buffer通常在中性的pH, 使用高浓度或者非常低浓度的盐离子来防止发生相分离现象。同时需要加入还原剂。常用的Buffer体系如下（pH 缓冲体系：50mM HEPES pH7.5, 盐离子：300 mM NaCl或者500 mM KCl, 或者不加盐离子，还原剂：1mM TCEP 或者5mM DTT ）。我们建议将蛋白分装后使用液氮速冻以后保存在低温的条件下，不要冻融蛋白，冻融会导致蛋白的聚集以及部分变性，影响其性质。在做相分离实验的时候，需要注意，对于每一个蛋白而言，都需要优化相应的PH，盐离子浓度以及温度等条件，尽量使其接近生理条件。详细的一些tips, 建议读者阅读另外一篇文章（Alberti et al., 2018）A User’s Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins
（4）Macromolecular Crowders（大分子簇）
相分离对物理化学条件的变化非常敏感。温度，蛋白，核酸或盐浓度的微小差异也会导致不同的结果。因此，体外相分离实验应精确控制缓冲液的体系和蛋白浓度。
在相分离的实验中，经常使用到一些Macromolecular crowders，比如：PEG，Dextran或Ficoll。很多情况下，添加到实验中的crowder的量可能超过存在于细胞内的环境。目前，crowder是如何促进相分离发生的具体的机制仍不明确，因此，应当慎重使用crowder。如果使用crowder，我们建议使用多种crowder做实验，以排除由于Crower带来的假阳性的结果（私底下听到过有老师提到，可能80%左右的蛋白在有Crower存在的时候都可以发生相分离）。
（5）小分子对于相分离的影响
在体外相分离实验体系中，可以测定LLPS是否改变酶的活性，从而研究相分离的生物学意义。在一些体外实验中，通常需要将高浓度的小分子化学物质（例如激酶抑制剂，甲基转移酶抑制剂等）添加到相分离体系中。此时应该考虑到，这些高剂量的小分子化学物质，除了本身对酶活的影响外，还可能对相分离产生直接作用，从而影响了酶活。
homotypic interactions
在体外，IDR通常足以介导相分离的发生。在高浓度下相分离的IDR的例子：Ddx4，LAF-1，FUS，hnRNPA1和Whi3的IDR。这些结果提示了这些IDR能够自主地通过homotypic interactions驱动相分离的发生。越来越多的证据显示，与同一多肽或其他蛋白其他区域的heterotypic interactions也可以驱动相分离的发生。
可否理解为：IDR是相分离发生的一个充分条件而不是必要条件。
（6）细胞内相分离现象
目前相分离领域的一个难点就是如何去鉴别细胞内的一些特殊的结构是否真的是相分离形成。在体外特定条件下，一些蛋白和RNA在足够的浓度或者合适的Buffer的情况下会发生相分离现象，通常通过在细胞内过表达这些蛋白，观察到形成较大的，球状的结构，以此来推测细胞内低浓度的该蛋白仍然会形成相分离，只是在普通的光学显微镜下无法检测到而已。然而，相分离需要足够浓度才能发生，因此，在使用过表达蛋白检测相分离的时候一定要考虑到外源过表达带来的影响。同时应该致力于寻找除过度表达之外的其他方式去证明细胞内确实发生了相分离现象。
内源表达蛋白质就是细胞本身DNA转录翻译所表达的蛋白质，外源表达蛋白质不是细胞本身DNA表达的蛋白质，需要转入外源DNA，由外源DNA表达的蛋白质。
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