泛素和泛素化介绍
泛素
泛素为含76个氨基酸、大小约为8.6 kDa的小蛋白质，在真核生物中普遍存在且高度保守。人类基因组中的四个基因编码泛素：UBB，UBC，UBA52和RPS27A。
泛素氨基酸序列：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG
泛素具有7个赖氨酸残基（K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63）和一个甲硫氨酸残基（M1）。泛素之间主要通过赖氨酸残基和甲硫氨酸残基进行各种连接。由此产生的泛素链产生一定的拓扑结构，可通过对蛋白底物进行修饰并决定底物的功能。
泛素化
将泛素添加到底物蛋白质中称为蛋白质的泛素化。蛋白质泛素化是一种动态的多方面翻译后修饰，涉及真核生物学的几乎所有方面。泛素化涉及三个主要步骤：活化，结合和连接，分别由泛素激活酶（E1），泛素结合酶（E2s）和泛素连接酶（E3s）执行。其中人源E1有2种：UBA1和UBA6；人源E2有35种；人源E3有数百种。
泛素化与去泛素化步骤
- 通过E1泛素激活酶激活泛素与ATP
- E2泛素结合酶的半胱氨酸活性位点与被E1泛素激活酶转移的泛素形成硫酯键
- E3泛素连接酶通过在泛素的Gly76的羧基与底物中的Lys的ε-胺之间形成异肽键而参与底物的泛素化
- 去泛素化酶（DUB）从底物中除去泛素并将泛素再循环到胞质池中
E3酶具有两个结构域之一：HECT结构域以及RING结构域。HECT结构域的E3连接酶先自身结合泛素然后将泛素转移至底物，而RING结构域的E3连接酶使E2酶直接将泛素转移至底物。
HECT结构域E3通过2种机制连接遍在蛋白质靶底物：首先，遍在蛋白从E2的活性位点转移到E3的活性位点中的Cys，然后遍在蛋白化目标底物中的Lys残基。相反，RING-和RING相关的结构域E3连接酶在一步中用作泛素化靶基质的支架：E2将遍在蛋白直接转移至靶底物中的Lys残基。
目前，人体内还存在E4酶。E4酶为泛素链延伸因子，能够对单泛素化的底物进行泛素链的延伸形成多聚泛素化。
图1 Ubiquitination
泛素化种类
单泛素化是在一个底物蛋白残基上添加一个泛素分子。 多单泛素化是将一个泛素分子添加到多个底物残基中。多泛素化是在底物蛋白上的单个残基上形成遍在蛋白链。目前，泛素可结合的底物残基有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸
根据泛素与底物的连接位点，目前有9种方式的泛素化，包括M1, K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63, G76。不同方式的泛素化调控不同的功能。其中，与蛋白酶体降解相关的泛素化为K48。
图2 function of ubiquitination
全面的蛋白质组学研究确定了成千上万种蛋白质上成千上万的泛素化位点。大多数蛋白质在其细胞寿命的某些时刻将经历泛素化。
蛋白质泛素-蛋白酶体降解研究思路
研究蛋白质泛素-蛋白酶体降解大部分是研究两个蛋白质之间的关系，即一个E3连接酶和一个底物蛋白。
底物蛋白的降解
CHX和MG132处理检测底物蛋白的降解
环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）为细胞内蛋白合成抑制剂。MG132为蛋白酶体抑制剂。
图3中，相对于MG132未处理组中SUBSTRATE蛋白在各时间点无明显变化，MG132处理组中的SUBSTRATE蛋白在2h、4h、8h的水平明显减小。说明SUBSTRATE的降解与蛋白酶体相关。
图3 用CHX和MG132处理细胞，在0h、2h、4h、8h时间点分别收细胞并裂解，用对应的抗体IB检测底物蛋白和内参
E3泛素连接酶能够促进底物蛋白的降解
图4中，随着E3泛素连接酶表达量的增加，底物蛋白的表达水平相应降低。图5中，随着E3泛素连接酶酶活性失活突变表达量的增加，底物蛋白的表达水平无明显变化。图6中，用E3泛素连接酶的siRNA敲低细胞内E3泛素连接酶的表达水平，底物蛋白的表达水平相应增加。图7中，过表达E3泛素连接酶酶，底物蛋白的半衰期减少。图8中，敲低E3泛素连接酶酶，底物蛋白的半衰期增加。说明E3泛素连接酶能降低底物蛋白的表达水平。
图4 梯度过表达E3泛素连接酶，24-48小时后收细胞并裂解，用对应的抗体IB检测E3泛素连接酶、底物蛋白和内参
图5 梯度过表达E3泛素连接酶酶活性失活突变，24-48小时后收细胞并裂解，用对应的抗体IB检测E3泛素连接酶、底物蛋白和内参
图6 敲低E3泛素连接酶，24-48小时后收细胞并裂解，用对应的抗体IB检测E3泛素连接酶、底物蛋白和内参
图7 过表达E3泛素连接酶，并用CHX处理，24-48小时后收细胞并裂解，用对应的抗体IB检测E3泛素连接酶、底物蛋白和内参
图8 敲低E3泛素连接酶，并用CHX处理，24-48小时后收细胞并裂解，用对应的抗体IB检测E3泛素连接酶、底物蛋白和内参
E3泛素连接酶和底物蛋白的相互作用
E3泛素连接酶和底物蛋白in vitro and in vivo的相互作用
使用免疫共沉淀的方法检测两个蛋白质之间的相互作用。大致分为以下三种：
- 两个蛋白均为过表达，见图9和图10。
- 一个蛋白为过表达，另一个为內源蛋白质，见图11和图12。
- 两个蛋白均为內源蛋白质，见图13和图14。
图9 共转染Flag标记的E3泛素连接酶和Myc标记的底物蛋白24-48小时后，用Flag抗体IP E3泛素连接酶，用相应抗体IB检测相应蛋白质
图10 共转染Flag标记的E3泛素连接酶和Myc标记的底物蛋白24-48小时后，用Myc抗体IP底物蛋白质，用相应抗体IB检测相应蛋白质
图11 转染Flag标记的E3泛素连接酶24-48小时后，用Flag抗体IP E3泛素连接酶，用相应抗体IB检测相应蛋白质
图12 转染Myc标记的底物蛋白质24-48小时后，用Myc抗体IP底物蛋白质，用相应抗体IB检测相应蛋白质
图13 裂解细胞后，用E3泛素连接酶的抗体IP，用相应抗体IB检测相应蛋白质
图14 裂解细胞后，用底物蛋白质的抗体IP，用相应抗体IB检测相应蛋白质
E3泛素连接酶和底物蛋白不同结构域的相互作用
通过文献或者生物信息学分析E3泛素连接酶和底物蛋白不同的结构域。图15上为E3泛素连接酶的不同结构域示意图：Domain1, Domain2, Domain3, Domain4；图15下为底物蛋白的不同结构域示意图：DomainA, DomainB, DomainC, DomainD。使用免疫共沉淀的方法检测两个蛋白质之间不同结构域的相互作用，见图16和图17。找到相应结构域后，检测这两个结构域之间的相互作用，见图18和图19。
图15 E3泛素连接酶和底物蛋白不同结构域示意图
图16 过表达Flag标记的E3泛素连接酶不同结构域24-48小时后，用Flag抗体IP，用相应抗体IB检测底物蛋白质
图17 过表达Flag标记的底物蛋白质不同结构域24-48小时后，用Flag抗体IP，用相应抗体IB检测E3泛素连接酶
图18 过表达Flag标记的E3泛素连接酶结构域和Myc标记的底物蛋白质结构域24-48小时后，用Flag抗体IP，用相应抗体IB检测底物蛋白质
图19 过表达Myc标记的E3泛素连接酶结构域和Flag标记的底物蛋白质结构域24-48小时后，用Flag抗体IP，用相应抗体IB检测E3泛素连接酶
E3泛素连接酶泛素化底物蛋白
底物蛋白能被泛素化
一般使用外源表达的泛素分子检测蛋白质的泛素化，也可使用內源的泛素抗体。因为泛素化为泛素分子与底物蛋白质的共价结合，SDS无法破坏此种相互作用力，所以图20中能够看到多聚泛素化链的存在。一个泛素分子大约为8.5KD，因此IB结果可能会出现基于底物蛋白质清晰的ladder带或smear带。
图20 过表达相应的蛋白24-48小时后裂解细胞，用Flag抗体IP底物蛋白，用相应抗体IB检测相应蛋白质
底物蛋白能被K48链泛素化
蛋白质泛素化为一种蛋白质翻译后修饰，能够调控蛋白质的功能。目前的泛素化种类有K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63，即泛素分子的K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63与底物蛋白质共价结合。一般认为，K48的泛素化可被蛋白酶体识别。因此，需要确认底物蛋白质的泛素链为K48链。将泛素分子赖氨酸单位点突变（见图21）或泛素分子单赖氨酸保留突变（见图23），通过免疫沉淀和免疫印迹的方法检测底物蛋白质泛素化的种类，见图22和图24。
图21 泛素分子赖氨酸单位点突变示意图
图22 外源表达泛素分子突变型和野生型，使用Flag抗体IP底物蛋白质，用相应抗体IB检测相应蛋白质
图23 泛素分子单赖氨酸保留突变示意图
图24 外源表达泛素分子突变型和野生型，使用Flag抗体IP底物蛋白质，用相应抗体IB检测相应蛋白质
E3泛素连接酶能泛素化底物蛋白
通过过表达（图25）或敲低（图26）E3泛素连接酶的方式检测底物蛋白质泛素化水平的改变。
图25 过表达E3泛素连接酶24-48小时后，裂解细胞，用Flag抗体IP底物蛋白质，用相应抗体检测相应蛋白质
图26 敲低E3泛素连接酶24-48小时后，裂解细胞，用Flag抗体IP底物蛋白质，用相应抗体检测相应蛋白质
体外泛素化实验
体外泛素化能够排除体内复杂的环境，让E3泛素连接酶直接与底物蛋白质作用，使E3泛素连接酶泛素化底物蛋白质更有说服力。体外UB, E1, E2, ATP以及buffer均有商业化试剂盒。只需纯化E3泛素连接酶和底物蛋白质进行体外泛素反应，检测底物蛋白质的泛素化。
图27 体外泛素化实验
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