文献信息

"Aminolated and Thiolated PEG-Covered Gold Nanoparticles with High Stability and Antiaggregation for Lateral Flow Detection of Bisphenol A"

Small 2018, 14, 1702828

DOI: 10.1002/smll.201702828

美国普渡大学

摘要

少数用于检测内分泌干扰化学物质双酚A (BPA)的横向流动分析(LFAs)采用了柠檬酸稳定金纳米颗粒(GNPs)，这存在不可避免的局限性和不稳定性问题。为了解决这些限制，通过设计用聚乙二醇修饰GNPs表面的策略，然后在LFA中测试其对BPA的有效性和敏感性，开发了一种更稳定、更灵敏的生物传感器。在不应用任何增强策略的情况下，这种改进的BPA LFA可以达到肉眼的检测极限(LOD)0.8 ng mL-1，是常规BPA LFAs的定量LOD的12.5倍，定量LOD为0.472 ng mL-1。该修饰的LFA具有应用于多种抗原检测的潜力。

研究背景

双酚A (BPA)是化学工程工业中有机材料的重要化学成分。在过去的几十年里，BPA的应用已经迅速扩大到包括食品工业、医疗领域、玩具制造业和消费品行业。迄今为止，BPA主要应用于聚碳酸酯和环氧树脂产品的制造。这种合成化学物质使用的增加使生活大大方便了。然而，尽管有这些好处，挑战也出现了，因为BPA也是一种内分泌干扰化学物质(EDC)，被怀疑是致癌物质。低剂量BPA暴露对人类健康有不良影响。由于其广泛的应用，BPA在环境中普遍存在，人类接触它是普遍的。因此，BPA的食品安全问题已经成为人们关注的焦点。由于含有BPA的产品无处不在，BPA的潜在风险和影响是广泛的。例如，双酚a被用来制造食物和饮料容器和金属食品罐的内衬，以防止腐蚀。大量研究表明，BPA会从容器中渗出，污染容器中的水和食物；此外，它还用于牙科填充物和医疗器械。此外，在收据纸表面发现了大量的BPA。由于BPA产品的普遍存在和我们环境中的严重污染状况，开发一种快速、经济、高灵敏度和极选择性的检测BPA的方法至关重要。

目前检测BPA的方法主要基于电子设备的使用，如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱和拉曼光谱。这些基于设备的方法对BPA检测具有高灵敏度和高选择性。然而，这些设备很昂贵，需要特殊的培训才能操作，而且测试很耗时。这些缺点阻止了它们的普及，使得现场检测的能力很少。为了方便BPA的现场检测，基于适体的方法和酶联免疫吸附法(ELISA)已经得到了广泛的研究和发展。适配体和ELISA的使用使研究人员避免了购买高成本设备的费用，在通往现场检测的道路上取得了巨大进展。然而，这些比色检测方法仍然涉及分离和洗涤步骤等程序，必须由训练有素的专业人员在专门的实验室进行。

为了使现场BPA检测可行，使用横向流动免疫测定法(LFIAs)或横向流动测定法(LFAs)来消除实验室检测的要求。LFAs是一种免疫层析方法，有三种操作模式，即竞争、三明治和多重格式，并将几种概念结合到一个微小、方便的设备中。LFAs已经成功克服了传统识别方法的缺点，传统识别方法依赖于训练有素的人员在实验室进行的实验。LFIAs提供了一种快速、廉价的单步样品处理，界面少，便携、高灵敏度、高选择性，在检测病原体方面有效。除了其他优点外，最显著的好处是LFA可以由未经训练的操作员进行。

横向流动(LFA)生物传感器已被应用于检测各种各样的物种，包括生物分子、病原体、污染物和过敏原。例如，使用磁性纳米颗粒检测大肠杆菌、牛奶中的孕激素、和过敏原小白蛋白。此外，研究人员继续通过增强LFAs的检测能力来改进LFAs，开发了用于大肠杆菌检测的酶扩增LFAs和通过等速电泳改进的LFAs等方法。

LFAs最重要的应用之一是检测BPA，因为BPA在食品和饮料包装塑料的制造中非常重要。人们每天都在不知不觉中接触到双酚a，并因此受到伤害。目前，有许多基于仪器的方法可以用于检测BPA。然而，目前缺乏现场BPA检测方法，少数研究集中在使用lfa检测BPA。首款BPA LFA于2013年开发同年，同一作者使用两种尺寸的金纳米颗粒(GNPs)和一个额外的共轭垫开发了一种用于BPA检测的放大LFA。2014年，Maiolini等人使用类似的LFA检测婴儿奶瓶中储存的水中的BPA。

上述所有研究都使用裸GNPs进行标记，这有内在的局限性。低频检测的主要问题来自于静电稳定GNPs的聚集对于大多数LFAs，其制备和实验过程都是在各种缓冲液中进行的，这些缓冲液需要预先调整到适当的pH值，以维持生物分子的正常功能。缓冲液通常含有氯化钠和KCI等成分，可大幅增加溶液中的离子浓度，并使GNPs上的静电双层收缩；这些层用于稳定GNPs并防止它们聚集。此外，生物识别分子与裸GNPs之间的结合依赖于较弱的二次键，如静电力、疏水力和给键。为了防止这些分子脱离表面并破坏GNPs上的静电双层，必须调整生物识别探针的pH值、数量和浓度。实验和生产过程中也存在重复的洗涤步骤，导致结合不成功。此外，由于正常GNPs的表面不受保护，仅由离子稳定，离子很容易被外来分子取代和中和，因此还需要额外的阻断序列和条带预处理来减少非选择性吸附的可能性。最后，由于BPA是一种相对简单、分子量只有228 Da的小化学物质，它不能同时与两个生物识别分子结合；因此，竞争模式已被采用作为BPA LF检测的标准分析方法。在竞争性检测中，降低标签(如GNPs)上生物探针(如抗体(Abs))的浓度是将检测限(LOD)降低到较低浓度的必要条件。这使得样本中较低浓度的抗原分子(BPA)与测试线上的抗原(4,4-双(4-羟基苯基)戊酸-牛血清白蛋白，BHPVA-BSA)竞争，以结合到LF条带测试区域的GNP-Ab上。但是，降低标签上探针的浓度会降低测试区域的颜色强度。在这种情况下，上述裸GNPs缺陷对标记产生负面影响，使其信号不清晰和不稳定，从而使抗原的定量复杂化。即使在标签表面和条带上应用各种复杂的阻断处理来稳定来自测试区域的波动信号，检测LOD附近低浓度的抗原也是具有挑战性的，因为对于常规GNPs来说，不稳定性和非选择性吸附是不可避免的，从而导致意外的假阳性或假阴性。

稳定纳米金是大多数LFA应用中遇到的主要问题之一。要保持它们的大小和形状，有几个先决条件。当周围环境发生变化时，GNPs的稳定性下降，这显著影响了采用竞争格式时BPA的检测。在之前使用裸GNPs的研究中，在生物探针和GNP偶联物组装完成后，应用多种阻断剂，如Abs、蛋白质(如牛血清白蛋白)和聚合物(如聚乙二醇、PEG)在GNP表面诱导空间位阻，提供额外的稳定性，减轻了上述检测的挑战。然而，后处理方法仍然依赖于相对不可靠的二级键。由于使用常规GNPs大大降低了BPA LFAs的准确性，增加了实验失败的可能性，并由于昂贵的生物材料的应用而增加了潜在的成本，因此出现了内在的问题。因此，为了将GNPs应用于LFAs，对包含初级键的GNP表面进行适当的修饰是非常可取的。为了解决上述问题，应该考虑对多用途聚合物聚乙二醇PEG进行结构改性的衍生物。由于其两亲性，PEG与大多数样品相容。PEG的分子结构简单，使聚合物稳定且具有惰性 。在本研究中，与以往使用常规GNPs的BPA LFA相比，使用定制的表面改性抗聚集GNP作为标签，建立了一种检测BPA的稳定性和灵敏度显著提高的新型LFA。这些GNPs包括金芯、硫代聚乙二醇保护层和装饰有胺基团的最外层。自订GNPs与常规GNPs的比较见图1。通过S-Au键在裸GNPs表面涂覆改性PEG可提高其稳定性，降低其对纳米颗粒的非选择性吸附。此外，几乎完全消除标签背景信号，使测试区域的信号更加清晰和强烈，明显提高了改性BPA LFA的灵敏度。与常规双酚a LFA相比，改性双酚a LFA对双酚a的定性和定量更准确、更简便。值得注意的是，由于改性GNPs的组成成功地防止了它们在带材制造和测试过程中聚集在各种缓冲液中，因此失败的实验和制造产生的浪费量显著减少。这些GNPs在LFA中的首次应用表明，该修饰成功地解决了BPA定量的问题，并有效地将BPA LOD降低到仪器检测水平。

Figure 1. Schematic illustration of the comparison of customized PEGylated GNPs and citrate GNPs. A) Functionalized surfaces orient the antibodies on the surfaces. B) Antibodies are firmly fixed on the surfaces by EDC/NHS chemistry. C) PEG layer prevents the particles from aggregating. D) Steric hindrance decreases nonselective adsorption. E,F) Antibodies are loosely and randomly attached to the surfaces by electrostatic forces. G) GNPs easily aggregate under different conditions. H) Undesirable adsorptions occur frequently. I) The customized particles move separately in a nitrocellulose membrane and successfully conduct target locating and decrease the possibility of false negatives/positives. J) Citrate/regular GNPs aggregate easily in the membrane and increase the possibility of false negatives/positives.

结果与讨论

在本研究中，我们对先前报道的BPA LFAs进行了改进，将定制的PEG化GNPs应用于LF条带，以实现更简单、更稳定、可靠和敏感的定量测量。改性BPA LFA的设计如图2所示。最初，我们开始通过研究柠檬酸GNPs和定制的PEG化GNPs来开发改性的BPA LFA。

Figure 2. Scheme of the modified PEGylated GNPs applied to a BPA LFA.

在我们将定制的GNPs应用于LFA之前，应该调整修改后的GNPs的光学特性。在LFA中，GNPs的颜色是决定性的，因为它决定了信号的清晰度和灵敏度。首先，基于Mie理论研究了常规GNPs的光学性质，并报告了有关表面等离子体共振(SPR)的计算。简而言之，通过计算GNPs的消光效率(Qext)来评价其SPR, Qext由吸附效率(Qabs)组成，包括吸收强度和入射光与光吸收的比值；散射效率(Qsca)包括散射强度和入射光与光散射的比值。这些值表示如下

公式.n-折射率；

由式(1)-(5)可知，直径为40 nm的GNPs在光共振波长(Amax)处的光学吸收最高，约为520 nm。在紫外波长附近吸收最强的GNP，预计产生的散射光波长在红外区域。此外，我们还观察到40 nm柠檬酸GNPs呈鲜红色，这是通过柠檬酸还原得到的。GNPs的大小变化对光谱红/蓝移影响微弱，颜色变化微弱，这对我们改进的BPA-LFA不利。

在评估常规和定制GNPs之前，还评估了所使用的HF 120膜。扫描电子显微镜(SEM)图像显示，HF 120硝化纤维素膜中存在100 ~ 20 μm大小的纤维素孔。因此，有利于膜内流动的最佳GNPs尺寸小于100 nm。

在对常规GNPs进行分析后，对改性GNPs上的PEG层进行了研究，因为上述方程表明，周围环境和颗粒表面的吸附材料对GNPs的颜色有显著影响。因此，我们评估了涂有PEG 1000、3000、5000、7000或10000的40 nm PEG化GNPs，并选择涂有PEG 5000的PEG化GNPs。涂有PEG-1000或3000的聚乙二醇化GNPs表现出较弱的抗聚集能力，而涂有PEG 7000或10000的GNPs在LFA中流动能力较差，颜色从红色转移。在选择了定义的PEG链后，在应用于LFA之前，分析了定制的PEG-5000涂层的尺寸为5、15和40 nm的GNP的光学性能。随着定制GNPs尺寸的增加，观察到与常规GNPs相似的红移行为。定制的PEG-5000涂层直径40 nm的GNPs显示出更亮的红色，更适合LFA。因此，考虑到GNPs在膜中的光学性质和流动能力，额外的LFA研究采用了40 nm的常规GNPs和定制GNPs，并使用5 nm、15 nm和40 nm的定制GNPs来确保定制PEG化GNPs的稳定性。

此外，利用透射电子显微镜(TEM)检测了在GNP表面存在PEG层。聚乙二醇化的GNPs表现出厚度为1nm的涂层，如“t”，而柠檬酸GNPs在颗粒周围没有显示外层。

为了进一步证实聚乙二醇层在颗粒上的存在，用透射电镜观察了阴性染色处理过的聚乙二醇覆盖GNPs和未覆盖PEG的GNPs(图3)。聚乙二醇化GNPs的透射电镜图像显示，在金核周围有一个由聚乙二醇层的污渍排斥作用产生的白色环，而柠檬酸GNPs的图像显示了被污渍包裹的GNP核。

Figure 3. Negative stain TEM images of a–c) 40 nm PEGylated GNPs and e–f) 40 nm citrate GNPs.

许多LFAs，包括BPA-LFAs，在缓冲液中进行，以使环境适合于测定中使用的生物组分。然而，常见的缓冲液中含有一定量的盐(如磷酸盐缓冲盐水(PBS)含有0.138 M NaCl)，会增加溶液中的离子浓度。离子浓度的增加会引起GNPs的不稳定和聚集。因此，在将GNPs应用于LFA之前，通过添加10% NaCl (100 μL)(图4)来复制纤维素膜中的高盐缓冲环境，评估并比较了PEG修饰的GNP和柠檬酸GNPs的稳定性。如图4b-e所示，柠檬酸GNPs在3 min内聚集，而定制的GNPs仍然分离。添加10% NaCl后，由于柠檬酸GNPs相互粘附形成较大的颗粒，其对可见光区的吸收大部分偏离可见光区，而定制的GNPs的吸收基本保持在原始波长范围内，仅略有下降。这一观察结果归因于定制的GNPs保持分离和粒子间距离的缩短。柠檬酸GNPs的zeta电位读数(40 nm)从-36到-4 mV急剧变化，而PEG GNPs(5、15和40 nm)在添加10% NaCl后仅略有降低，分别为9、8、6 mV。在随后的实验中，我们添加了BSA作为稳定柠檬酸GNPs的阻断剂，结果显示添加NaCl后也有相似的聚集水平。结果表明，在LF测试过程中，柠檬酸GNP发生了聚集，而定制的聚乙二醇化GNP在样品流过膜时不受离子浓度的干扰。

Figure 4. The stability evaluation of the PEGylated GNPs (numbers 2, 3, 4, 6, 7, and 8) and citrate GNPs (numbers 1 and 5) following the addition of 10% NaCl, as determined by UV–vis spectroscopy and TEM. a) Scheme of the changes in the PEGylated GNPs and citrate GNPs before and after the addition of 10% NaCl. b) The appearance changes resulting from GNP aggregation in the PEGylated GNPs before and after the addition of 10% NaCl (before: numbers 2, 3, and 4; after: numbers 6, 7, and 8) and citrate GNPs (before: number 1; after: number 5). c) Absorption spectra of the 40 nm PEGylated GNPs (brown line) and 40 nm citrate GNPs (green line). d) Absorption spectra and TEM images of the 40 nm PEGylated GNPs before (blue line) and after (red line) adding 10% NaCl. e) Absorption spectra and TEM images of the 40 nm citrate GNPs 40 nm before (blue line) and after adding 10% NaCl.

在稳定性评估和光学性能调整后，PEGylated的GNPs作为实验组(I)应用于BPA横向流动测试，而在其表面涂有BSA阻断剂的柠檬酸GNPs，如先前报道的[16]也应用于BPA横向流动测试(II)作为对照组(图5)。图5a显示，II组在对照和测试区域外显示出强烈的红色(即背景区域)，而第一组在背景区域没有显示颜色。I组和II组膜背景区红色(光密度)的差异源于聚乙二醇化GNPs和柠檬酸GNPs在水溶液中的溶解度和聚集倾向的差异。与定制的聚乙二醇化GNPs相比，当样品流经膜时，柠檬酸GNPs更不溶于水溶液，并且更有可能从水和骨料中分开移动。PEG层通过硫醇牢固地固定在定制的GNPs表面，使颗粒由于其增加的溶解度而与样品溶液一起移动，并防止颗粒在流动过程中聚集，这导致背景区域几乎没有光密度。此外，改性BPA-LFA的LOD显著。裸眼LOD定义为能区分阴性对照条和试验条强度差异的抗原最低浓度。在I组中，与负1号条带相比，2号条带上检测区域的强度和大小可见，导致肉眼LOD为0.0008 ug/mL。在第二组中，如果不使用高分辨率扫描仪，区分条带1、2和3是困难的。因此，肉眼LOD定义为条带号4，对应于0.01 ug/mL BPA浓度。I组的裸眼LOD是II组的12.5倍。此外，通过确定峰值区域的强度，生成I组和II组的校准曲线，如图5b所示。从两条校准曲线可以看出，组I的校准曲线斜率比组II的校准线斜率大3倍，说明改性BPA LFA对BPA具有更高的敏感性。这一结果是由于测试区域和背景区域的强度结合造成的。用高分辨率扫描仪测定改性BPA LFA的定量LOD为0.000472 μg/mL，而常规BPA LFA的定量LOD仅为0.00109 μg/mL。在这里，定量LOD定义为BPA浓度导致10%在较低的BPA浓度下比常规的BPA LFA更准确。与负条带的强度相比强度的降低。值得注意的是，改进的BPA LFA的校准曲线。

Figure 5. Comparison of the modified BPA LFA (with the customized PEGylated GNPs, I) and regular BPA LFA (with the citrate GNPs, II) using dif�ferent BPA concentrations conducted in PBS solution. 1) Negative, 2) 0.0008 µg mL−1 = 0.8 ppb, 3) 0.004 µg mL−1 = 4 ppb, 4) 0.01 µg mL−1 = 10 ppb, 5) 0.03 µg mL−1 = 30 ppb, and 6) 0.06 µg mL−1 = 60 ppb. Each intensity value is the average of three measurements.

将改性GNPs与柠檬酸GNPs的BPA横向测试进行比较，在硝化纤维膜上添加抗鼠抗体(控制线1)，评价其在GNP表面的非特异性吸附性能，该控制线不能与改性GNPs和常规GNPs表面的兔抗BPA抗体发生反应。控制线1位于测试线和常规控制线(控制线2)之间(图6)。通过将不含BPA的样品滴到样品垫上，观察GNP表面吸附来进行测试。改良BPA LFA和常规BPA LFA各进行10次条带试验，每组重复3次(每组共30次)。根据我们的经验，控制线的强度随金表面抗BPA Ab的浓度而变化；因此，将图5和图6中改性BPA LFA和普通BPA LFA的控制线强度以及改性GNPs和柠檬酸GNPs表面的Abs数量调整为相同。在这些测试中，改性的BPA LFA显示了A所示结果的100%，而添加BSA阻断剂的常规BPA LFA显示了B所示结果的73.3%和C所示结果的26.6%。这些结果表明，BSA阻断剂在柠檬酸GNPs表面有26.6%的非选择性吸附的可能性，而未添加任何阻断剂的改性GNPs表面没有任何不良的吸附。此外，根据抗体结构，在重链基因的c端剪接中编码有赖氨酸残基，称为“c端赖氨酸剪接”。通过将图6a中的条带图像与图5b中的校准曲线进行比较，可以分析修改后的GNPs上Abs的方向。由于改性GNPs表面的Abs具有良好的1-乙基-3-(3 -二甲基氨基丙基)-碳二亚胺- HCI (EDC)/ n -羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学取向，它们能够更好地捕获抗原在检测区域，导致检测线路的信号面积在A比在C的面积更大。图5b中的校准曲线显示，改性GNPs上的抗BPA抗体数量与柠檬酸GNPs上的抗BPA抗体数量大致相等，表明改性GNPs上的抗体-抗原(Ab-Ag)结合性能更有效、更高效。

Figure 6. The unwanted (nonselective) adsorption tests and the evaluation of Ab orientations on the GNP surfaces of A) the modified BPA LFA and B,C) regular BPA LFA (B (73.3%) and C (26.6%)). a) Strip images and signal intensity profiles of the modified BPA LFA and regular BPA LFA. b) Theoretical explanations for the sensitivity of A) the modified BPA LFA compared to that of B,C) the regular BPA LFA (B (73.3%) and C (26.6%)).

此外，使用与BPA结构相似的常见化学物质对改性的BPA LFA进行了选择性评价，包括双酚BP，双酚C和己烯雌酚。所有这些化学物质的浓度都进行了调整0.1 ug/mL。从图7可以看出，即使双酚BP、双酚C和己烯雌酚浓度很高，也不能降低检测区域的强度，说明改性BPA LFA对BPA具有高度特异性。

Figure 7. Evaluating the selectivity of the modified BPA LFA. Tested chemicals (0.1 µg mL−1 = 100 ppb): 1) BPA, 2) bisphenol BP, 3) bisphenol C, and 4) diethylstilbestrol.

最后，通过对真实自来水样品的加标和回收试验，检验了改性BPA LFA的实用价值(表1)。在本实验中，自来水中加标了已知数量的不同浓度的BPA(样本号1-5)。这一结果与PBS溶液中BPA样品的检测结果吻合较好，证明了我们改进的BPA LFA可用于检测环境中BPA的存在。

Table 1. Spike and recovery test for modified BPA LFA using real tap water samples.

结论

裸GNPs的局限性导致有价值材料的巨大损失，并使现有的LF产品不稳定，不适合长期使用。因此，在本研究中，我们开发了一种先进的BPA LFA，该LFA含有GNPs，用固定的PEG层修饰，装饰有额外的官能团，并显示出许多用于BPA检测的优点。PEG分子在纳米颗粒表面产生空间位阻，增加了GNPs在水溶液中的溶解度，减少了非选择性吸附。此外，外官能团可以通过EDC/NHS化学结合Abs，使Abs定向，提高Ab-Ag结合效率。PEG层的这些好处极大地降低了BPA LFA的背景信号，提高了GNPs在膜中的流动能力，降低了假阴性/阳性的概率，消除了使用常规GNPs可能产生的不稳定性，并提高了测定的灵敏度。在不使用任何增强策略的情况下，裸眼LOD显著提高至0.8 ng/mL，与常规BPA LFA相比增加了12.5倍；定量LOD为0.472 ng/mL，比常规BPA LFA增加了3倍。值得注意的是，尽管PEG包被的GNPs在这项工作中被应用于BPA的检测，但定制颗粒对LFA的应用可以扩展到任何一种病原体。我们相信这项研究将成功地为先进的LFA应用开辟新的机会。